脂肪乳对布比卡因致原代培养海马神经元细胞毒性的影响

曹红丽， 摆志霞， 陈学新

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院肿瘤医院麻醉科，银川 750004）

布比卡因（bupivacaine，BPV）为酰胺类长效局部麻醉药，在临床上被广泛应用于蛛网膜下腔阻滞、硬脊膜外阻滞和外周神经阻滞，如用量超过限量或不慎误入血管可导致严重的中枢神经系统和循环系统毒性。中枢神经系统的毒性反应常早于心血管系统的毒性反应，且药量低于心脏毒性发生的剂量[1]。患者一般表现为肌肉抽搐、惊厥甚至昏迷。海马被认为是布比卡因神经毒性的关键部位[2-3]。脂肪乳剂（lipid emulsion，LE）是从大豆油中提取长链甘油三酯和蛋黄磷脂制成的混合物，已被部分麻醉科纳入了局麻药毒性救治指南[4-5]。但其具体作用机制仍不清楚。本文主要研究脂肪乳在救治布比卡因引起的大鼠海马神经元细胞毒性作用中对细胞活力和动作电位的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂材料与仪器

布比卡因注射液（上海朝晖药业有限公司，1908J09），20%脂肪乳剂（四川科伦药业有限公司），CCK-8 试剂盒（Dojindo 公司），动作电位采集软件（HEKA 公司，Patchmaster），分析软件（HEKA公司，IGOR），放大器（HEKA 公司，EPC-10），微操纵器（Sutter Instruments 公司，MP285），拉制仪（Sutter Instruments 公司，P97）。

1.2 原代细胞培养与分组

选取新生24 h 内的SD 大鼠（SPF 级），购自北京大学医学部实验动物科学部，实验动物生产许可证号：SCXK［京］2016-0010。75%酒精全身消毒，断头处死。无菌条件下取出全脑，分离海马组织，消化过滤收集细胞悬液，用DMEM/F12 重悬并计数，接种于多聚赖氨酸包被的96 孔板和24 孔板上，置于37 ℃含5%CO2培养箱中培养。2 h 后接种液清洗1 次，接种24 h 后将培养液更换成含B27 的Neurobasal Medium 神经元完全培养基（B27 可选择性促进神经元生长，抑制神经胶质细胞生长）。此后每3 d 更换一次培养液，每次半量换液，培养至第9 天用于实验。神经元采用神经元微管相关蛋白2（microtubule associated protein 2，MAP-2）抗体进行纯度鉴定，纯度达到90%以上可用于实验。

将原代培养的海马神经元细胞分为4 组：空白对照组（Control）不做任何处理，布比卡因组（BPV）加入1 mmol·L-1布比卡因，脂肪乳剂组（LE）加入1%脂肪乳剂，布比卡因+脂肪乳剂组（BPV+LE）加入1 mmol·L-1布比卡因和1%脂肪乳剂。各组细胞均处理24 h 后用于下一步实验。

1.3 采用CCK-8 法检测细胞活力

吸去96 孔板中原来的培养基，每孔加入100 μL含10% CCK-8 的新鲜培养基，37 ℃孵育2～3 h，然后用酶标仪测定450 nm 处的吸光度（A），细胞活力（%）=（A加药-A空白）/（A未加药-A空白）×100%。加药：指有细胞、CCK-8 和药物的溶液；未加药：指有细胞和CCK-8 溶液而无药物溶液；空白：指有培养基和CCK-8 溶液而无细胞。该实验重复3次，每次设5 个平行孔。

1.4 动作电位记录所用液体

细胞外液:140 mmol·L-1NaCl，3.5 mmol·L-1KCl，1 mmol·L-1MgCl2，2 mmol·L-1CaCl2，10 mmol·L-1D-Glucose，10 mmol·L-1HEPES（pH=7.4 NaOH调节）。细胞内液:20 mmol·L-1KCl，115 mmol·L-1K-aspartic，1 mmol·L-1MgCl2，5 mmol·L-1EGTA，10 mmol·L-1HEPES，2 mmol·L-1Na2-ATP（pH 7.2 KOH 调节）。

1.5 电生理膜片技术对各组细胞的动作电位进行检测

采用全细胞记录法，将记录模式改为电流钳模式，电流维持于0 pA 0.2 s，然后从0 pA 开始以5 pA 为步阶逐渐增加至75 pA 维持0.8 s，再返回至0 pA 维持1 s，每根间隔5 s。实验数据由EPC-10 放大器进行采集并储存于PatchMaster 软件中。用微电极拉制仪将毛细玻璃管拉制成记录电极。在倒置显微镜下操纵微电极操纵仪将记录电极接触到细胞上，给予负压抽吸，形成千兆欧姆（GΩ）封接。形成封接后进行快速电容补偿，然后继续给予负压，吸破细胞膜，形成全细胞记录模式。然后进行慢速电容的补偿并记录膜电容及串联电阻，每组对6 个细胞进行动作电位的检测。

1.6 统计学方法

数据采用SPSS 21.0 软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组海马神经元细胞活力检测

如图1 所示，与Control 组比较，BPV 组细胞活力降低（P<0.05）；与BPV 组比较，BPV+LE 组细胞活力增高（P<0.05）。

2.2 各组海马神经元动作电位的检测指标

2.2.1 神经元动作电位原始电流图 4 组神经元动作电位原始电流图见图2。

2.2.2 动作电位幅度（action potential amplitude，APA） 如图3 所示，各组细胞间APA 差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2.3 动作电位时程（action potential duration，APD） 如图4 所示，BPV 组细胞APD 较Control 组增高（P<0.05）。与BPV 组相比，BPV+LE 组APD降低（P<0.05）。

2.2.4 动作电位幅度对应的峰值（peak amplitude） 如图5 所示，各组细胞动作电位幅度对应峰值差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

布比卡因作为临床常用的局部麻醉药，多年来对其系统毒性的研究不断深入。随着麻醉技术的不断发展，超声引导下的外周神经阻滞方法已经广泛应用于临床工作中，使得局麻药中毒发生的概率大大降低，但仍为0.04‰~1.8‰[6]。一旦发生局麻药中毒的情况往往是致命的，所以对于其系统毒性的研究非常必要。在局麻药中毒的病例中，只发生中枢神经系统毒性者占47%，只发生心血管毒性反应者占24%，同时发生中枢神经毒性和心血管毒性者占33%[7]。因此，对布比卡因引起的神经毒性进行研究有着非常重要的临床意义。

脂肪乳剂最早是作为一种肠外营养药物在临床上应用的。自1998 年由Weinberg 等[8]首次提出脂肪乳可作为救治布比卡因毒性的用药以来，无论是对其心脏毒性的研究还是神经系统毒性的研究都证实了其确切作用：脂肪乳剂能与脂溶性局部麻醉药结合将其从浓度高的组织运送至浓度低的组织器官进行解毒[9-11]。采用脂肪乳剂来救治布比卡因引起的毒性反应已有很多个案报道，明确了其具体的用法及用量[7]。脂质池理论证实了脂肪乳剂对脂溶性局麻药毒性反应的确切作用[12]。胰岛素信号通路在脂肪乳剂救治布比卡因毒性反应中也发挥着作用[13]。还有实验证实，布比卡因可影响线粒体膜的通透性，并且对线粒体内氧化呼吸链产生一定作用[14]。本课题组前期的研究结果也证实了脂肪乳剂能减轻布比卡因对海马神经细胞活力的抑制作用[15]。

海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源性干扰因素作用的细胞模型，在体外实验研究中被广泛应用。有研究报道[16]，布比卡因对大鼠海马神经元微型兴奋性突触后电流和微型抑制性突触后电流有影响。因此，本实验在此基础上应用膜片钳技术对体外培养的原代大鼠海马神经元细胞进行了全细胞动作电位的检测分析，排除了在体实验的生理环境对实验的影响。可兴奋性细胞动电位的产生是由于Na+内流达到阈值后引发的，并且具有全或无的特点[17]。本实验结果中，4 组神经元细胞动作电位幅度对应峰值差异无统计学意义。细胞活力的检测结果显示，BPV 组细胞活力下降而BPV+LE 组细胞活力升高，这与之前的研究结果相似[15]。虽然检测方法存在差异，但布比卡因对神经细胞活力的影响和脂肪乳剂对布比卡因细胞毒性的解救作用是一致的。

综上所述，布比卡因对海马神经细胞的活力有抑制作用，并使其动作电位也产生了变化。脂肪乳剂能有效缓解布比卡因引起的神经细胞毒性，使细胞存活率提高，并减轻布比卡因对海马神经元细胞动作电位的影响。