Ang1-7 对肥厚心肌CX43 表达的影响

马全萍， 于 欣， 戴亚东， 张德凯， 杨 震

（1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.海原县人民医院心内科，海原 755200； 3.宁夏医科大学检验学院，银川 750004； 4.宁夏医科大学总医院心脏中心内科，银川 750004）

由高血压引起的心室代偿性肥厚存在缝隙连接重构，主要表现为缝隙连接蛋白43（connexin43，CX43）的表达和端-端连接减少，而侧向化和异质分布增加。缝隙连接的这种重构在肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）病 理生理表现中起主要作用，很可能是HCM 致心律失常形成的病理基础，其有助于产生和维持与HCM 相关的心律失常[1]。其中CX43 丝氨酸残基368 磷酸化位点（phosphorylation of serine residue 368-CX43，PS368-CX43）减少被认为是在心肌损伤后心律失常发生的关键机制[2]。有研究证实[3]，PS368 是CX43 中蛋白激酶C 磷酸化的主要结合点，该作用点减少被证明是细胞间通讯减少和单通道行为改变的基础。自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）因其肥厚心肌的病理生理和人类高血压致慢性心肌肥厚病理生理过程极为相似而成为研究慢性心肌肥厚的理想模型，被广泛用于研究从代偿性左心室肥大（left ventricular hypertrophy，LVH）到收缩期（HF）的转变[4]。血管紧张素1-7（angiotensin1-7，Ang1-7）因拮抗血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）而表现为降压、抗心肌肥厚等心脏保护作用已被广泛证实[5-6]。本研究以SHR 为心肌肥厚研究对象，分析Ang1-7 对SHR 血压、心肌肥厚程度及Total-CX43/PS368-CX43 表达的影响，探讨Ang1-7 预防心肌肥厚和心律失常的作用，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级16 周雄性WKY 大鼠5 只、SHR 10只［动物许可证编号SCXK（京）2016-0006，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司］，室内温度（23±2）℃，24 h 自由摄食水。5 只WKY 大鼠作为正常血压对照组（n=5），10 只SHR 随机分为安慰剂组（SHR+NS）和Ang1-7 干预组（SHR+A）各5只。SHR+A 组：Alzet 微渗泵入Ang1-7，400 ng·（kg·min）-1[7]；SHR+NS 组：Alzet 微渗泵入生理盐水，400 ng·（kg·min）-1，均连续28 d。

所有动物实验程序均经宁夏医科大学动物护理和使用委员会批准，所有手术均在麻醉下进行。

1.2 主要试剂

Ang1-7（5 mL/支，美国Med ChemExpress 公司）；Alzet 微型渗透压泵（2 mL，美国Alzet 公司）；Total-CX43 /PS368-CX43（200 μL，美国Thermo Fisher 公司）；BCA 蛋白定量试剂盒、膜蛋白提取试剂盒及配胶试剂盒（江苏凯基生物技术有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠尾动脉血压测量 所有动物在干预前利用卡尔文鼠尾动脉血压仪med lab 尾套法测收缩压（SBP）[8]。每只动物测量3 次，取其平均值，干预28 d 后再重复上述测量进行比较。

1.3.2 苏木精-伊红（HE）染色 左心室心肌组织石蜡切片，HE 染色后镜下观察大鼠心肌组织病理形态变化（正常心肌组织可见心肌细胞排列整齐，组织结构清晰，细胞核分布均匀有序）。

1.3.3 免疫组化 左心室心肌组织石蜡切片，免疫组化染色观察Total-CX43 和PS368-CX43 在心肌的分布。阳性表达显示Total-CX43 和PS368-CX43 在心肌细胞与细胞之间端-端连接处，呈棕褐色，结果经Image J 分析，Graphpad 作图比较。

1.3.4 Western blot 检测 膜蛋白提取试剂盒提取左心室心肌组织蛋白，行Western blot 检测分析Total-CX43 和PS368-CX43 在心肌组织的表达变化，凝胶电泳Total-CX43 和PS368-CX43 蛋白条带在Marker 标记分子量40 附近显示，Western blot 蛋白条带及灰度分析软件分析，比较各组Total-CX43/ PS368-CX43 蛋白平均光密度值与内参GAPDH 平均光密度比值。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，当方差齐性时，组间比较采用单因素方差分析；当方差不齐时，用Welch-Aspin 检验法进行比较；组间多重比较采用LSD-t检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ang1-7 对SHR 血压的影响

干预前与WKY 组相比，SHR+NS 组和SHR+A 组大鼠SBP 均升高（P均<0.01）；干预后SHR+NS组和SHR+A 组大鼠的SBP 均高于WKY 组，SHR+A 组血压较SHR+NS 组下降（P均<0.01），见表1。

表1 三组大鼠干预前后SBP 变化情况

2.2 Ang1-7 对肥厚心肌组织学的影响

HE 染色显示，WKY 组大鼠心肌排列整齐，组织结构清晰，细胞核分布均匀有序；SHR+NS组心肌排列紊乱，组织结构欠清晰，细胞核分布显著减少，SHR+A 组介于两者之间（图1）。

2.3 Total-CX43 及PS368-CX43 的免疫组化检测

免疫组化结果显示，Total-CX43 与PS368-CX43 均位于心肌细胞端-端连接处，呈棕褐色，见图2。

WKY 组、SHR+NS 组和SHR+A 组大鼠Total-CX43 分别为（10.8253±0.4957）、（5.1430±1.0002）和（7.7923±0.6620），PS368-CX43 分别为（17.0290±1.7907）、（8.1860±0.4677）和（13.5157±0.6014）。SHR+NS 组 和SHR+A 组 大 鼠Total-CX43、PS368-CX43 水平均低于WKY 组，SHR+NS 组大鼠Total-CX43、PS368-CX43 水平均低于SHR+A 组（P均<0.01），见图3。

2.4 Total-CX43 及PS368-CX43 的Western blot检测

WKY 组、SHR+NS 组和SHR+A 组大鼠Total-CX43 分别为（0.9592±0.0531）、（0.3514±0.0270）和（0.5128±0.0268），PS368-CX43 分别为（3.8039±0.0708）、（1.5603±0.0442）和（2.6958±0.0717）。SHR+NS 组 和SHR+A 组 大 鼠Total-CX43、PS368-CX43 水平均低于WKY 组，SHR+NS 组大鼠Total-CX43、PS368-CX43 水平均低于SHR+A 组（P均<0.01），见图4。

3 讨论

CX43 是心室间隙连接的主要蛋白质，它是用于心脏电传导的低电阻导管，是心脏电生理研究的重要靶点。研究证明，许多降压药物和减轻心室肥厚的肾素-血管紧张素-醛固酮系统（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS）抑制剂，诸如依那普利[9]、螺内酯[10]等都具有预防心律失常的作用。但这些作用都是建立在其抑制RAAS 系统而发挥降压和对抗心肌肥厚作用的前提和基础之上，因为它们都要通过改变心脏肥厚才能发挥作用，这样过程就会比较缓慢而结果又不太确定。因此，开发一种可以直接影响心肌电生理传导而发挥抗心律失常作用的药物非常必要。本研究旨在研究Ang1-7 对肥厚心肌CX43 及PS368磷酸化水平表达的影响，来探讨Ang1-7 是否具有通过影响Total-CX43 /PS368-CX43 表达变化而表现出预防心肌肥厚心律失常的作用。经过研究发现，经Ang1-7 干预后的SHR 血压下降，HE 染色显示心肌肥厚较安慰剂组明显减轻。免疫组化和Western blot 检 测 显 示，Total-CX43 及PS368-CX43 在肥厚心肌中表达均降低，而经Ang1-7干预后其表达增加。从而证明Ang1-7 可以影响肥厚心肌Total-CX43/PS368-CX43 的表达，与Kasi 等[11]的研究结果一致。

据报道，在幼年（3 个月）和老年（12 个月）SHR 中，CX43 的表达在心肌中显著下降，并且经补充omega-3 多不饱和脂肪酸后升高[12]。Bacharova等[13]研究发现，CX43 的表达下降是导致心室肥大早期的原因。对于心脏特异性血管紧张素转换酶过度表达的转基因小鼠，其表现出室性心动过速（ventricular tachycardia，VT）的倾向和由于CX43 减少而导致的猝死，可以通过拮抗RAAS增加CX43 及其磷酸化对应物的总量，降低VT诱导能力和提高存活率，表明干预RAAS 可以减轻CX43 的损伤[14-15]。本研究以幼年遗传性高血压模型SHR 为研究对象，模拟人类在慢性高血压基础上形成心肌肥厚的病理生理过程。Ang1-7为外源性RAAS 拮抗因子，干预SHR 的RAAS过度激活。本研究结果也证明，3～4 个月的SHR 心肌肥厚显著，免疫组化和Western blot 检测CX43和PS368 表达较WKY 组下降；而经Ang1-7 干预后，下降的Total-CX43 和PS368-CX43 得到恢复，起到了预防心肌肥厚和心律失常的作用。

综上，Ang1-7 经SHR 皮下微渗泵入不但可降压、减轻心肌肥厚，同时具有增加Total-CX43及PS368-CX43 在肥厚心肌表达的效应，表现出潜在抗肥厚心肌心律失常的作用。Ang1-7 影响肥厚心肌中Total-CX43/PS368-CX43 表达的作用机制，是否是建立在其降压和逆转心肌肥厚的基础上还不确定，尚不能证明它具有独立抗心肌肥厚而直接影响Total-CX43/PS368-CX43 表达的作用，其作用机制还有待进一步研究。