宁夏无果枸杞芽水提物对老年小鼠Wnt 通路信号分子表达的影响

韩怀钦， 陈海军， 孙向平， 王艳平， 丁银秀， 文玉军， 张莲香

（1.宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室，银川 750004； 2.宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，银川750004； 3. 南通市第一人民医院普外科，南通 157001； 4 宁夏回族自治区中医医院暨中医研究院，银川 750021）

衰老所致认知功能减退与脑组织抗氧化及清除自由基能力降低、神经干细胞增殖能力减低、凋亡和坏死细胞增多有关[1-2]。课题组前期研究发现，宁夏无果枸杞芽水提取物（aqueous extract of fruitless lycium sprout，AEFLS）可提高老年小鼠抗氧化和自由基清除能力，减少神经元凋亡，提高海马区神经细胞增殖率[3-4]，改善老年小鼠学习记忆能力[5]，其具体机制尚不清楚。研究表明[6]，Wnt/βcatenin信号通路在细胞增殖、分化、凋亡和衰老等方面扮有重要的角色，在胚胎发育早期通过调节细胞的增殖和分化来影响神经系统的形成。AEFLS 是否可通过调节Wnt/β-catenin 信号通路关键分子发挥神经保护作用？研究其抗衰老和神经保护作用机制对筛选抗衰老药物、预防和降低增龄所致神经退行性疾病的发生具有重要意义。为此，本研究以自然衰老小鼠为模型，观察AEFLS对小鼠海马Wnt 通路信号分子人叉头框蛋白O1（forkhead box protein O1，FoxO1）、β-连环蛋白（βcatenin）及T细胞特异性转录因子4（T cell specific transcription factor 4，TCF4）表达的影响，以期为进一步阐明AEFLS 抗衰老机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

选取BL/6JC57 健康雄性小鼠，SPF 级（宁夏医科大学实验动物中心提供），动物合格证号为SCXK（宁）2011-0001，体质量25~30 g，喂养于昼夜12 h 交替、室温保持在（24±2）℃的环境中。取10 只6 月龄鼠做为成年对照组，40 只13 月龄鼠随机分为AEFLS 低浓度组（AEFLS1 组）、中浓度组（AEFLS2 组）、高浓度组（AEFLS3 组）和老年对照组，每组10 只；所有小鼠在实验前适应1 周。

1.2 主要仪器和试剂

石蜡切片机（Leica，德国），电泳槽、酶标仪、凝胶成像仪（Bio-Rad，美国），无果枸杞芽购自宁夏明德医药有限公司，兔抗TCF4 单克隆抗体、兔抗鼠FoxO1、β-catenin 多克隆抗体、SP 试剂盒（北京中杉公司），全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒（南京凯基公司），SDS-PAGE 凝胶试剂盒、SDS 蛋白上样缓冲液（北京康为公司），ECL发光试剂盒（Thermo，美国）。引物的设计与合成（上海生工），Trizol 试剂（Invitrongen，美国），逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR 试剂盒（Takara，美国）。

1.3 方法

1.3.1 AEFLS 的制备及给药方法AEFLS 的制备采用水提法，制备的浸膏每克含无果枸杞芽生药量约2.67 g。小鼠给药方法参考文献［3-4］，持续给药8 周。

1.3.2 取材 1）灌注取材及石蜡切片的制备每组各取5 只小鼠，用10 %水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉后，行左心室-主动脉灌注，先用37 ℃的生理盐水快速灌注至流出液体为无色时，用4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液（0.01 mol·L-1，pH：7.35~7.45）先快速后缓慢灌注20 min，充分固定后，迅速取脑组织置于4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液中，4 ℃冰箱后固定过夜，至脑组织下沉至瓶底后取出，将脑组织分为前后两部分修块，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋。将包埋好的组织修块，切片，片厚6 μm，裱片，37 ℃烤片过夜或60 ℃烤片2 h，4 ℃保存备用。2）新鲜取材 各组小鼠干预8 周后每组取5 只，用10 %水合氯醛深麻醉后断头取脑，冷PBS 液中剥除脑表面被膜，迅速取出海马组织，于液氮中低温速冻（部分用RNA safe 保存液冻存），后置于-80 ℃冰箱保存，作为Western blot 和RT-PCR 备用。

1.4 RT-PCR 技术检测小鼠海马FoxO1、β-catenin、TCF4 mRNA 的表达

取RNA safe 保存液冻存的小鼠海马组织100 mg，解冻后在4 ℃用Trizol Reagent 提取总RNA，NanoDrop 2000 c 行核酸浓度测定，用Easy-Script First-Strand cDNA Syntheswas SuperMix 试剂盒将提取的RNA 反转录为cDNA，用1 μg 的cDNA 行RT-PCR，同种属的GAPDH 作为内参。BioRad 软件进行分析。采用Comparative Delta-CT相对定量法计算相对基因表达。GAPDH、FoxO1、β-catenin 和TCF4 引物的设计与合成由上海生工完成，RT-PCR 结果的相对定量值计算公式：2－［（实验组-GAPDH）－（对照组-GAPDH）］。

1.5 Western blot 技术检测小鼠海马区FoxO1、β-catenin、TCF4 蛋白的表达

冷冻海马组织梯度解冻后，加蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，比例为100:1，玻璃匀浆器匀浆，4 ℃离心15 min，提取总蛋白并测定浓度后按照Western blot 技术的操作步骤进行蛋白电泳和转印，在凝胶成像仪下进行观察并拍照，Image-J 统计光密度值，以GADPH 作为内参，计算FoxO1、β-catenin 及TCF4 蛋白的相对表达值。

1.6 尼氏染色

取片厚6 μm 石蜡切片，按照常规尼氏染色步骤染色，高倍镜下观察各组小鼠海马齿状回内颗粒细胞层神经元的尼氏染色特点。

1.7 免疫组织化学染色检测小鼠海马区FoxO1、β-catenin 和TCF4 蛋白的表达

将石蜡包埋的组织连续切片，片厚6 μm，间隔5 片取1 片，具体操作按照SP 法说明书的操作步骤进行免疫组织化学染色，阴性对照省去一抗用0.01 mol·L-1PBS 液代替。显微镜下观察海马区免疫阳性染色，FoxO1、β-catenin 和TCF4 蛋白免疫反应阳性为细胞被染棕色或棕黄色颗粒。每张切片选取3 个不重复视野，高倍镜下观察，拍照，用图像分析软件Image-Pro Plus Version 6.0统计阳性细胞的平均光密度值。

1.8 统计学方法

数据用SPSS 17.0 软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析；对于非正态分布资料，组间比较采用Kruskal-WallisH检验。P≤0.05为差异有统计学意义。采用软件Graph Pad Prism 5.0进行作图。

2 结果

2．1 尼氏染色

尼氏染色可见各组小鼠海马CA3 内锥体细胞层蓝色深染的细胞数不同。成年对照组小鼠锥体细胞层深蓝细胞较多，老年对照组小鼠深染细胞明显减少。给予低浓度AEFLS 干预后，颗粒下层蓝色深染的细胞并未增多；给予中浓度AEFLS干预后，内颗粒细胞层蓝色深染细胞明显增多；给予高浓度AEFLS 干预后，蓝色深染细胞多于低浓度组，少于中浓度组，见图1。

2.2 RT-PCR 检测结果

各基因的荧光定量PCR 表现为单一的溶解峰，均为特异性扩增。与成年对照组比较，老年对照组小鼠海马区FoxO1 mRNA 和β-catenin mRNA 表达水平下降，TCF4 mRNA 表达水平上升（P均<0.05）；与老年对照组比较，AEFLS3 组海马区β-catenin、FoxO1 mRNA 表达水平升高，TCF4 mRNA 表达水平下降（P均<0.05）。AEFLS1 和AEFLS2 组海马区三个基因的mRNA 表达水平与老年对照组比较差异均无统计学意义（P均>0.05），见图2。

2.3 Western blot 检测结果

与成年对照组比较，老年对照组小鼠脑海马区FoxO1、β-catenin 蛋白表达均下降，TCF4 蛋白表达增加（P均<0.05）。与老年对照组比较，AEFLS2 组β-catenin 蛋白的表达升高，TCF4 蛋白表达降低（P<0.05），AEFLS3 组的FoxO1、β-catenin蛋白表达均升高，TCF4 蛋白表达降低（P<0.05），见图3。

2.4 免疫组织化学染色结果

各组小鼠海马区均可见FoxO1、β-catenin 及TCF4 免疫阳性细胞，其中AEFLS2 组脑组织中的血管和脑室脉络丛血管也可见FoxO1、βcatenin 及TCF4 免疫阳性细胞，免疫阳性细胞主要为海马锥体细胞层细胞和齿状回外颗粒细胞层细胞。

与成年对照组比较，老年对照组小鼠海马CA3 区FoxO1、β-catenin 蛋白的表达下降，TCF4蛋白表达增高（P均<0.05）；与老年对照组比较，AEFLS2 组小鼠脑海马CA3 区β-catenin 蛋白的表达升高（P<0.05）；AEFLS3 组小鼠脑海马CA3区FoxO1、β-catenin 蛋白的表达均升高，TCF4 蛋白表达降低（P均<0.05）。见图4～7。

3 讨论

随着老龄化社会的到来，衰老所致老年病的发病率呈逐年上升趋势。衰老所致神经功能减退是老年痴呆及帕金森等疾病发生的病理生理基础。增龄相关的神经功能减退与脑组织抗氧化及自由基清除的能力下降，活性氧自由基的堆积增多，神经细胞增殖、分化减少，凋亡、坏死细胞增多等多方面因素有关[1-2]，目前其机制还不清楚，因此探讨衰老机制、研究抗衰老的药物成为当前神经科学关注的热点。

枸杞的抗衰老作用早在南朝齐梁时代的《神农本草经》已列为上品。关于枸杞抗衰老机制研究较多，课题组前期研究发现宁夏枸杞新品AEFLS 可提高老年小鼠抗氧化和自由基清除能力，提高海马区神经细胞增殖率，减少神经元凋亡，改善老年小鼠学习、记忆能力[3-6]。为进一步研究其作用机制，本研究观察了不同浓度的AEFLS 对老年小鼠海马Wnt 通路信号分子Fox－O1、β-catenin 及TCF4 表达及齿状回颗粒细胞下层神经元的影响，结果显示：老年鼠海马组织中Wnt/β-catenin 通路信号分子的表达与成年鼠不同，其中β-catenin 和FoxO1 mRNA 和蛋白表达水平均下降，TCF4 蛋白表达水平增高，当给予AEFLS 灌胃老年小鼠8 周后，高浓度的AEFLS 使衰老小鼠脑海马区FoxO1、β-catenin mRNA 和蛋白表达增加，TCF4 mRNA 和蛋白表达降低。

本实验尼氏染色观察到：AEFLS2 组小鼠海马CA3 区锥体细胞层嗜碱性蓝色深染的细胞明显多于AEFLS1、AEFLS3 组及老年对照组，表明中浓度的AEFLS 可促进海马区神经元DNA 复制。在成体中枢神经系统，神经干细胞主要存在于脑室的室管膜下层和海马齿状回的颗粒细胞下层等脑区，提示AEFLS 可能引起海马区神经细胞的增殖[4]。本研究的前期结果亦表明老年小鼠海马齿状回神经细胞增殖率极低；当给予AEFLS 灌胃老年小鼠8 周后，中、高浓度的AEFLS使衰老小鼠使海马齿状回神经细胞的增殖率增高[4]。

研究表明，Wnt 信号通路参与机体多种组织、细胞的再生、增殖、凋亡和衰老的调控[7-10]。在衰老进程中，机体因自由基的清除能力降低造成自由基的堆积，处于氧化应激状态，此时Wnt 信号通路未被激活，细胞浆内游离的β-catenin 与FoxO1 竞争性结合，以蛋白酶体的形式被降解，在胞浆内浓度较低，β-catenin 与FoxO1 的结合抑制了β-catenin 与TCF 的结合，抑制Wnt/βcatenin 信号通路下游基因转录与表达，进而抑制神经细胞的增殖和分化[11-12]。Wnt/β-catenin 信号通路不仅参与氧化应激介导的神经细胞衰老的调控，也参与了氧化应激介导其它器官细胞衰老的调控[13-15]。当给予中、高浓度的AEFLS 后，因AEFLS 含有丰富的多酚类物质、维生素E、维生素C 及儿茶素等生物活性成分，可提高衰老脑组织自由基清除能力和抗氧化能力[3-6]。此时Wnt信号通路被激活，抑制了β-catenin 的磷酸化，去磷酸化的β-catenin 不能与FoxO1 竞争性的结合，未降解的β-catenin 积聚并迁移至核内与下游转录因子TCF 结合，启动下游基因转录和表达，促进海马齿状回神经细胞的增殖。AEFLS 可能通过调节Wnt/β-catenin 信号通路关键分子的表达促进海马齿状回神经元增殖，发挥神经保护作用[3-6]。文彬等[16-17]在有关鳖甲煎丸对Wnt 信号通路信号分子影响的研究，也证实了Wnt/β-catenin信号分子参与神经保护机制。孙向平等[18]研究表明宁夏AEFLS 对Wnt/β-catenin 通路关键分子参与了小鼠肠道衰老的保护作用。

综上，宁夏AEFLS 通过提高衰老脑组织的抗氧化能力、降低或抑制脑组织过氧化损伤、降低神经细胞的凋亡、促进脑海马区神经细胞的增殖及延缓自然衰老导致的认知功能减退，可作为抗衰老、药食两用且具有宁夏地方特色的中药材。Wnt/β-catenin 信号通路关键分子参与神经细胞增殖与衰老、凋亡的调控机制，但Wnt/βcatenin 信号通路与氧化应激、与神经细胞增殖、衰老、凋亡以及与其他信号通路的关系非常复杂，其机制需更深入的研究。