大气PM2.5 对大鼠胰岛素瘤细胞凋亡及胰岛素分泌的影响

朱丽敏， 刘贺荣， 李丽萍

（宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川 750004）

糖尿病是由于机体胰岛素分泌缺陷和（或）胰岛素作用缺陷所引起的以慢性血葡萄糖水平增高为特征的内分泌-代谢性疾病[1]。随着生活水平日益提高及老龄化社会的出现，糖尿病患病率逐渐增高，流行范围极广，在严重威胁人类健康的同时，给个人和社会带来沉重的经济负担，已成为影响我国居民健康和社会经济发展所面临的严峻挑战[2]。PM2.5是指大气中空气动力学直径≤2.5 μm 的细颗粒物。PM2.5粒径小，富含大量的有毒、有害物质且在大气中停留时间长、输送距离远，因而对人体健康和大气环境质量有很大影响[3-4]。大量研究证明大气PM2.5暴露浓度不仅是人体呼吸系统疾病的主要影响因素，还与人群死亡率、心脏系统患病率、糖尿病等慢性病的发生成正相关[5-7]。本研究以大鼠胰岛素瘤细胞（INS-1细胞）为靶细胞，观察PM2.5对INS-1 细胞凋亡及胰岛素分泌的影响，为2 型糖尿病的预防及PM2.5对人体健康危害的研究提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株 大鼠胰岛素瘤细胞（INS-1 细胞，博慧斯生物医药科技有限公司，中国）。

1.1.2 仪器与试剂 RPMI-1640 培养基（BI 公司，以色列）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，BI 公司，以色列）、2β-琉基乙醇（Sigma 公司，美国）、PBS 缓冲液（pH=7.4，Hyclon）、四甲基偶氮唑盐（MTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（江苏凯基生物技术公司，中国）、活性氧（ROS）检测试剂盒（碧云天生物技术公司，中国）、酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，中国）、二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白含量检测试剂盒（江苏凯基生物技术公司，中国）、细胞凋亡检测试剂盒（上海贝博生物技术公司，中国）、智能大容量空气总悬浮微粒采样器（TH-150C，中国）、9 cm×9 cm 高纯度玻璃纤维膜、冷冻干燥机、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、CO2培养箱、酶标仪（Thermo Fisher 公司，美国）、Sysmex 流式细胞仪（Sysmex 公司，德国）、荧光倒置显微镜（奥林巴斯公司，日本）及低温台式冷冻离心机（Thermo Fisher 公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5细颗粒物的采集和处理 选取银川市第十九小学旁街道，采用智能大容量空气总悬浮微粒采样器和9 cm×9 cm 高纯度玻璃纤维膜，采样流量为100 L·min-1，每天24 h 连续采集，采集1 周。采样后取下滤膜放置于-20 ℃保存。将滤膜剪成1 cm×4 cm 大小浸入275 mL 超纯水中，超声处理80 min（温度20 ℃）后用5 层纱布过滤。滤液置于-80 ℃冰箱中低温冷冻3 h，后用冷冻干燥机处理至水分完全蒸发。收集灰黑色絮状物，将收集物放入干净的玻璃瓶中置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 PM2.5悬浮液的配制 称取一定量PM2.5，经紫外线照射30 min，用含10%胎牛血清RPMI-1640 完全培养基分别配制成浓度为200、20、2、0 μg·mL-1的悬浮液，吹打使颗粒物充分混匀。

1.2.3 INS-1 细胞的培养 将INS-1 细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培养基（含50 μmol·L-1巯基乙醇、5.6 mmol·L-1葡萄糖、0.11g·L-1丙酮酸钠、10%FBS、1%双抗）中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每1~2 d 换培养基1 次，2~3 d 传代1 次。

1.3 检测指标与检测方法

1.3.1 INS-1 细胞存活率测定及MTT 试验 取生长状态良好的INS-1 细胞胰酶消化后按3×104个/孔的密度接种于96 孔板上，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养至细胞铺满孔底，弃旧培养液，PBS 缓冲液洗涤后，分别加入含不同浓度（200、20、2、0 μg·mL-1）PM2.5的培养基进行染毒处理，每组均设3 个复孔。后将96 孔板置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中，分别在24 h、48 h、72 h 后按MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测方法在490 nm 下检测光密度值，细胞存活率（%）=（OD实验组- OD空白组）/（OD对照组- OD空白组）×100%。由于PM2.5本身对吸光度的测定有一定影响，因此在计算细胞存活率时空白组为各组PM2.5本底值。

1.3.2 INS-1 细胞内ROS 检测 取生长状态良好的INS-1 细胞胰酶消化后按2×105个/孔的密度接种于6 孔板上，每孔加培养基2 mL 置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。次日待细胞贴壁后，PBS缓冲液洗涤后，分别加入含不同浓度（200、20、2、0 μg·mL-1）PM2.5的培养基进行染毒处理，每组设3 个复孔，继续在培养箱中培养12 h，弃培养液，用PBS 缓冲液洗涤2 次，每孔加入1 mL DCFH-DA（终浓度10 μmol·L-1），37 ℃、5%CO2培养20 min后，弃去孔内液体，PBS 缓冲液洗涤3 遍，胰酶消化收集细胞，1000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，加入2 mL 冷PBS 缓冲液重悬细胞，采用荧光分光光度计在488 nm 激发波长、525 nm 发射波长下测定细胞内DCFH-DA 荧光强度，以此表示INS-1 细胞内ROS 水平。

1.3.3 GSIS 实验测细胞胰岛素分泌量 取生长状态良好的INS-1 细胞胰酶消化后按2.8×105/孔的密度接种于24 孔板，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h 后弃培养液，PBS 缓冲液洗涤后，分别加入含不同浓度（200、20、2、0 μg·mL-1）PM2.5的培养基进行染毒处理，每组设3 个平行孔，继续在培养箱中培养24 h 后弃培养液，用无糖的KRBH 缓冲液（115 mmol·L-1NaCl，5 mmol·L-1KCl，1 mmol·L-1MgCl2，24 mmol·L-1NaHCO3，2.5 mmol·L-1CaCl2，10 mmol·L-1HEPES，0.5%BSA）冲洗INS-1 细胞两次，每孔加入200 μL 含3 mmol·L-1葡萄糖的KRBH 缓冲液平衡1 h，弃上清，每孔加入含5.6 mmol·L-1、16.7 mmol·L-1葡萄糖的KRBH液200 μL 分别干预细胞1 h，收集每孔上清液，采用胰岛素酶联免疫吸附测定试剂盒于450 nm波长条件下检测各孔吸光度值。用物理法裂解细胞，用二喹啉甲酸法检测每孔细胞蛋白总量。每孔胰岛素分泌水平以每孔细胞总蛋白量校正：单位质量蛋白质胰岛素浓度（μIU·g-1，以蛋白计）=每孔胰岛素含量（μIU）/每孔细胞总蛋白含量（g）。

1.3.4 流式Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡 取生长状态良好的INS-1 细胞胰酶消化后按2×105个/孔的密度接种于6 孔板上，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，待细胞贴壁后，加入含不同浓度（200、20、2、0 μg·mL-1）PM2.5的培养基进行染毒处理，每组设3 个复孔，染毒12 h 后弃培养液，胰酶消化收集细胞，用预冷的PBS 离心洗涤两次，加入500 μL Binding Buffer 重悬细胞，调整细胞密度约为1×106个/ml，在细胞悬液中再加入5 μL Annexin V-FITC 染色液，轻轻混匀后在2～8 ℃避光条件下孵育15 min 后，加入10 μL PI 染色液后轻轻混匀，于2～8 ℃避光条件下孵育5 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。记录INS-1 细胞总凋亡率和晚期凋亡率来表示其凋亡水平。

1.4 统计学方法

数据均采用SPSS 22.0 统计软件进行录入和分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用one-way ANOVA，两两比较采用Dunnett-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PM2.5 对INS-1 细胞活率的影响

与0 μg·mL-1组比较，PM2.5染毒INS-1 细胞24 h 时，20、200 μg·mL-1组的INS-1 细胞活率均降低（P＜0.05）；染毒48h 和72 h 时，2、20、200 μg·mL-1组的INS-1 细胞活率均降低（P＜0.05），见图1。

2.2 PM2.5 对INS-1 细胞内ROS 水平的影响

与0 μg·mL-1组比较，200 μg·mL-1组INS-1细胞内ROS 含量升高（P＜0.05），见图2。

2.3 PM2.5 对INS-1 细胞胰岛素分泌量的影响

如图3 可见，在基础浓度葡萄糖（5.6 mmol·L-1）和高浓度葡萄糖（16.7 mmol·L-1）刺激下，与0 μg·mL-1组比较，200 μg·mL-1组胰岛素分泌水平下降（P<0.05）。

2.4 PM2.5 对INS-1 细胞凋亡的影响

由图4 可知，与0 μg·mL-1组比较，2、20、200 μg·mL-1组细胞晚期凋亡率均升高，20、200 μg·mL-1组细胞总凋亡率均升高（P均＜0.05）。

3 讨论

国际糖尿病联盟数据显示，2017 年中国居民糖尿病患病率不断增高，估计20～79 岁人群糖尿病患病率为10.9%[8]。与此同时，PM2.5已成为危害最重大气污染物之一[9-10]。目前，关于PM2.5与心血管系统疾病和呼吸系统相关疾病等之间的研究已经相对成熟[11-15]。流行病学研究发现，环境污染严重的地区居民糖尿病的发病率高于其他地区[16]。因此，PM2.5与糖尿病之间的联系尚有待进一步探索。

研究表明，胰岛β 细胞的凋亡是致使其减少的主要原因，又因为合成和分泌胰岛素是胰岛β细胞特有的功能，由此可导致胰岛损伤和胰岛素分泌异常，继而导致糖尿病的发生或加重，目前有研究证实了胰岛β 细胞的凋亡是糖尿病发生的中心环节[14]。此外，一些体外细胞实验和动物实验均证实PM2.5对机体的损伤与机体的炎症反应和氧化应激关系十分密切，吸入PM2.5可引起相应炎症通路和炎症转录因子激活，促使炎症因子表达，从而导致多种组织受到炎症因子攻击[15-19]。同时，PM2.5可使细胞ROS 水平异常升高而导致氧化应激[20]。无论炎症反应还是氧化应激都会对胰岛产生损伤，使胰岛β 细胞凋亡。

本实验通过构建体外INS-1 细胞模型，进行PM2.5干预，通过检测细胞活力、胰岛素分泌水平、ROS 水平和细胞凋亡率，探讨PM2.5对于INS-1细胞的凋亡及胰岛素分泌的影响。

MTT 试验是体外细胞试验用于检测细胞存活和生长的实验方法。本研究结果显示，随着PM2.5浓度的增加，细胞存活率均逐渐下降，表明PM2.5可抑制细胞增殖，对INS-1 细胞具有一定毒性作用，使细胞的活力降低，这与已有相关文献研究结果一致[21-22]。GSIS 实验是体外用于评价胰岛β 细胞功能的最常用的方法。本研究结果显示，在基础葡萄糖（5.6 mmol·L-1葡萄糖）和高浓度葡萄糖（16.7 mmol·L-1）刺激下，200 μg·mL-1组胰岛素分泌水平下降，表明PM2.5可抑制INS-1细胞胰岛素分泌水平。

胰岛β 细胞是唯一分泌胰岛素的细胞，其功能缺陷是血糖代谢紊乱的中心环节。β 细胞中抗氧化酶含量低，极易受到氧化应激的影响，导致细胞数量的进行性减少和细胞功能的恶化。本研究结果显示，200 μg·mL-1组INS-1 细胞内ROS含量升高，表明PM2.5可引起INS-1 细胞ROS水平上升，对INS-1 细胞有氧化损伤作用，与雷春霞等[20]研究结果一致。

凋亡是细胞受基因调控的一种程序性死亡，它是一种自然死亡的过程，与生长分化同样是多细胞生物生命活动中必不可少的过程。当机体受到外来因素作用时，往往会通过诱导细胞凋亡而导致细胞功能降低。本研究发现，2、20、200 μg·mL-1组细胞晚期凋亡率均升高，20、200 μg·mL-1组细胞总凋亡率均升高，表明PM2.5可诱导INS-1 细胞发生凋亡。

综上所述，PM2.5可抑制INS-1 细胞活力，降低INS-1 细胞胰岛素分泌水平，其可能机制为通过诱导INS-1 细胞ROS 水平增高，发生氧化损伤，进而诱导了INS-1 细胞凋亡。