携载FGF2基因的改性壳聚糖微球促进兔桡骨骨缺损修复的研究

陈胤贤 蒋健一 赵宇 孙军

感染、创伤、肿瘤等造成的大范围骨缺损是临床的一大难题。常见的修复方法，如自体骨移植、异体骨移植、人工材料等，存在创伤大、供体骨有限、费用高等缺点，组织工程技术为解决这一难题提供了新的可能。

碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)因可在体外促进BMSCs增殖及成骨分化，被广泛应用于骨缺损研究[1-2]。但是，骨缺损的修复用时较长，局部加入FGF2易被代谢，无法长时间维持生物活性。因此，基因治疗被用于骨缺损修复，而合适的基因载体尤为重要[3-4]。我们的前期工作证实，壳聚糖具有极好的生物相容性和低细胞毒性，且经过改性后制成巯基烷基化壳聚糖(Thiolated N-alkylated chitosan，TACS)和羟丁基壳聚糖(Hydroxylbutyl chitosan，HBC)，可先后通过正负电荷作用包裹基因，形成以TACS为核、HBC为壳的纳米粒子，该粒子可在体内缓慢降解，释放目的基因转染细胞表达蛋白，从而发挥生物活性[5]。

本研究旨在探究改性壳聚糖携载FGF2基因在体内促进兔桡骨临界骨缺损愈合过程中的作用，以期为临床骨缺损的修复提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

实验动物：共使用15只3月龄新西兰兔(安徽医科大学动物实验中心)，体质量约3.0 Kg，雌雄不限。

实验材料：兔BMSCs(赛业生物科技有限公司)； HBC和TACS(中国科学技术大学材料与化学研究实验室馈赠)；pFGF2基因过表达载体(上海吉凯基因科技有限公司)；质粒大量提取试剂盒(天根生物科技有限公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；CCK8试剂(日本同仁公司)；PCR试剂盒、引物(上海锐博生物科技有限公司)；兔抗兔FGF2抗体、HRP标志的山羊抗兔IgG(美国Sigma公司)。

1.2 HBC@TACS-pFGF2基因载体微球的制备

体外扩增培养基因过表达菌株，用质粒大量提取试剂盒收集菌体提取质粒，Nano Drop2000测定质粒浓度，标记浓度后置于-20 ℃保存。参照前期研究方法，壳聚糖与质粒的氮磷比为20∶1(氮元素代表壳聚糖的相对分子质量，磷元素代表质粒的相对分子质量)，在无菌条件下将TACS与pFGF2质粒于PBS缓冲液中混匀、涡旋震荡30 s后室温静置30 min形成TACS-pFGF2，然后再向溶液中加入与TACS等量的HBC，涡旋震荡30 s，混匀后室温静置30 min，制备成HBC@TACS-pFGF2基因载体微球，置于-20 ℃备用[5]。

1.3 HBC@TACS-pFGF2与BMSCs共培养

1.3.1体外转染BMSCs

将BMSCs按5 000个/孔接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，于培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后加入质粒含量为5 μg的HBC@TACS-pFGF2基因载体微球，继续培养1、3、7 d后弃去培养基，PBS冲洗2遍后加入RIPA裂解液，冰上30 min裂解细胞，12 000 r/min、4 ℃离心15 min，吸去上清液，提取蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，每孔上样量30 μg。转膜后FGF2抗体以1∶1 000进行稀释，孵育过夜，二抗以1∶5 000进行稀释。ECL法曝光获得图像。Image J软件分析条带灰度，以目的蛋白与内参蛋白GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的比值判断蛋白表达的相对含量。

1.3.2细胞活力检测

用含10%FBS的DMEM培养基培养兔BMSCs，待细胞融合至80%～90%时进行消化传代，取第3～6代细胞用于实验。

取生长状态良好的细胞进行消化，离心，重悬细胞，调整细胞数目，按2 000个/孔的密度将细胞接种于96孔板，每孔加入100 μL含10%FBS的DMEM完全培养基，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后吸去培养基，向孔板中加入含有不同浓度pFGF2质粒(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL)的HBC@TACS-pFGF2基因载体微球。不加HBC@TACS-pFGF2基因载体微球的孔板设为对照。将细胞继续置于培养箱中培养72 h后吸去培养基，每孔加入100 μL完全培养基和10 μL的CCK8溶液，37 ℃孵育4 h，测量450 nm处吸光度(OD值)，计算细胞增殖率。

1.3.3RT-PCR检测成骨相关基因和成血管相关基因的表达

将BMSCs按照5 000个/孔接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，置培养箱培养过夜，待细胞贴壁后加入含HBC@TACS-pFGF2基因载体微球的DMEM，其中pFGF2质粒浓度为100 μg/mL。分别培养3 d、7 d后弃去培养基，PBS冲洗2遍TRIzol裂解细胞，提取RNA。用PrimeScript RT Enzyme Mix I将RNA逆转录合成cDNA。用荧光SYBR Green QPCR Master Mix(TakaRa)进行PCR(表1)。应用Applied Biosystem7300/7500和StepOnePlus Real-Time PCR System 进行实验。PCR反应预变性温度：95 ℃，30 s，1个循环。循环反应温度：95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，40个循环。扩增结果用 QuantStudio Real-Time PCR Software进行分析。

表1 实时定量RT-PCT引物Table 1 Quantitative realtime RT-PCR primer sets

1.4 兔桡骨骨缺损修复实验

无菌条件下将明胶海绵切割成18 mm×20 mm大小[6]，将pFGF2质粒浓度为100 μg/mL的HBC@TACS-pFGF2缓慢滴加到明胶海绵中。无菌条件下将明胶海绵冻干，防止手术过程中因挤压造成基因载体丢失。将明胶海绵压缩,卷成18 mm长的柱状备用。

新西兰兔麻醉后仰卧位，无菌条件下切开皮肤，暴露桡骨，去除中段包括骨膜在内的长18 mm的桡骨，制备双侧桡骨临界骨缺损模型，左侧植入明胶海绵和HBC@TACS-pFGF2微球(实验组，n=15)，右侧不作植入(对照组，n=15)。缝合后消毒包扎，并用3 M软石膏将兔前肢固定。术后分笼饲养，术后3 d皮下注射青霉素防止术后感染。移植术后第4周、8周、12周分别取材，行X线检查、大体观察，骨标本经10%EDTA脱钙后切片，行Masson染色，观察新生骨组织的矿化情况。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 Western-blot检测FGF2蛋白表达情况

HBC@TACSpFGF2基因载体微球与BMSCs体外共培养后可成功表达FGF2蛋白，且随时间增长FGF2蛋白的表达水平有增高趋势(图1)。

图1 共培养第1、3、7天后western-blot检测FGF2蛋白表达情况Fig. 1 The expression of FGF2 protein detected by western-blot after 1, 3 and 7 days of co-culture

2.2 细胞活力检测

与对照组相比(对照组细胞活性以100%表示)，不同TACS@HBC-pFGF2浓度条件下，BMSCs的相对增殖率分别为111.6%±7.59%、136.9%±3.127%、154.2%±5.34%、84.9%±3.20%、14.1%±1.96%。随着pFGF2质粒浓度的提高，BMSCs的增殖率逐渐增高，当pFGF2质粒浓度达到100 μg/mL时细胞增殖率最高，当pFGF2质粒浓度为200 μg/mL、300 μg/mL时细胞增殖率骤降。说明体外培养时适当添加pFGF2质粒可促进BMSCs增殖，但是pFGF2质粒浓度过高可对细胞产生毒性。因此，后续实验选取100 μg/mL作为pFGF2质粒的浓度(图2)。

2.3 ALP mRNA和CD31 mRNA的表达情况

BMSCs在体外与pFGF2质粒浓度为100 μg/mL的TACS@HBC-pFGF2共培养后，其成骨相关基因碱性磷酸酶ALP mRNA和成血管相关基因CD31 mRNA的表达量随时间推移逐渐增高，且在第7天时其表达量与对照组相比具有明显差异(图3)。

2.4 大体标本观察

对照组在第4～8周时缺损断端骨痂形成不明显，缺损长度仍为18 mm，术后第8～12周时对照组的骨缺损断端开始形成较多骨痂，并可见缺损逐渐变小，但是在第12周时骨缺损依旧存在，断端未连续。实验组在第4周时即可观察到明显的骨痂形成并伴有纤维组织将断端连接，在第8周时骨痂已将缺损填充，第12周时骨缺损基本修复，桡骨连续性好(图4)。

图3 HBC@TACS-pFGF2与BMSCs共培养3 d、7 d后ALP mRNA和CD31 mRNA的表达情况 (*： 与对照组相比，P<0.05；**： 与对照组相比，P<0.01)Fig. 3 The levels of ALP mRNA and CD31 mRNA of BMSCs co-cultured with HBC@TACS-pFGF2 for 3 and 7 days (*: compared with control group, P<0.05; **: compared with control group, P<0.01)

A：对照组；B：实验组 A: Control group; B: Experimental group图4 术后不同时间点桡骨标本大体观察Fig. 4 Gross observation of radius at different time points after surgery

2.5 影像学检查

对照组在第4周时未见明显骨痂形成，缺损处由软组织填充，术后第8周时可见骨缺损断端骨痂形成向缺损处延伸，第12周时少量骨痂连续，缺损范围变小，但骨缺损依旧存在。实验组在第4周时即可观察到明显骨痂形成，骨缺损部位已由新生骨痂填充，骨密度明显增高，第8周时骨痂重塑，缺损部位骨痂密度进一步增高，第12周时骨缺损已完全修复，并可见桡骨髓腔已再通(图5)。

2.6 组织学检查

对照组在移植术后第4周、8周、12周时骨缺损未能完成修复，骨缺损断端可见大量蓝染的纤维组织形成，随时间推移，第12周时对照组可见少量新生骨组织矿化。实验组骨缺损部位随时间推移纤维组织逐渐被新生骨组织代替，相较于对照组可见到更多矿化的新生骨，第12周时实验组骨缺损已完全修复，Masson染色可见大片红色深染的已矿化的新生骨组织(图6)。

3 讨论

FGF2可以在体外促进BMSCs的增殖、软骨分化和成骨分化，参与骨组织的形成和重塑[7]。研究证明，10 ng/mL的FGF2可在体外促进BMSCs增殖，并且在共培养7 d后ALP mRNA和Runx2 mRNA的表达显著增高[1-2]。另有研究表明，FGF2对多种参与血管生成的细胞具有很强的促增殖作用。但FGF2的临床应用受到半衰期短、快速稀释和代谢、重复注射的潜在毒性及免疫原性等的限制[3]。因此，我们设想利用基因治疗的方法将FGF2应用于骨缺损修复。基因载体需要满足转染效率高、细胞毒性低等条件[4，8-9]。壳聚糖是广泛存在于自然界中的一种甲壳素脱乙酰基衍生物，具有良好的生物相容性。壳聚糖及各种改性壳聚糖作为药物缓释载体已被广泛研究[10-12]。我们前期研究发现，壳聚糖经化学改性后可作为基因载体，当壳聚糖中的氮元素与基因中的磷元素分子量比值为20∶1时，改性壳聚糖TACS可通过正负电荷作用将基因进行包裹，表面电荷为正电荷，易被细胞内吞进行后续转染[13]。另外，在该结构外面继续包裹与TACS等质量的HBC制成核壳结构后，可以达到缓慢释放TACS-pFGF2粒子进行转染的目的[5]。

A：对照组；B：实验组 A: control group; B: experimental group图5 术后不同时间点桡骨X线图片Fig. 5 X-ray images of radius at different time points after surgery

A：对照组；B：实验组 A: control group; B: experimental group图6 术后不同时间点骨缺损处Masson染色(标尺=100 μm)Fig. 6 Masson staining of the bone defect at different time points after surgery (scale=100 μm)

前期实验中确定了HBC@TACS-pEGFP在体外的释放动力学。在37 ℃的TE缓冲溶液中HBC和TACS缓慢降解生成水和二氧化碳，逐渐释放出pEGFP，在第7天时约15%的pEGFP被释放，第15天时释放率约50%，第30天时释放率约70%[5]。本研究首先选用了低剂量的HBC@TACS-pFGF2在体外与BMSCs共培养，Western-blot证实了共培养后BMSCs可成功表达FGF2蛋白，并且随时间推移蛋白表达量有增高趋势。

细胞毒性实验证实HBC@TACS-pFGF2可在体外促进BMSCs增殖，而且随着pFGF2质粒浓度的提高，BMSCs的增殖率逐渐增高，在pFGF2质粒浓度为100 μg时BMSC增殖率可达到对照组的(154.2%±5.34%)，但是继续提高浓度后BMSCs增殖率开始下降，这可能与过多的质粒存在细胞毒性有关。

另外，Liu等[14]研究表明，FGF可以在体外通过BMP/Smad信号通路促进BMSCs增殖分化。本研究利用PCR检测了HBC@TACS-pFGF2与BMSCs共培养后相关成骨基因与成血管基因的mRNA表达情况，证实HBC@TACS-pFGF2可提高ALP和CD31基因的表达。因此，我们大胆猜测，HBC@TACS-pFGF2可以在体内骨缺损部位转染BMSCs提高成骨基因、成血管相关基因的表达，以促进骨缺损的修复过程。

本研究建立兔双侧桡骨18 mm缺损模型，实验组植入明胶海绵和HBC@TACS-pFGF2微球，对照组不作植入。移植术后第4周、8周、12周收集标本分别进行大体观察、X线检查、Masson染色等。结果发现，术后4周、8周、12周时，实验组兔桡骨缺损处的骨缺损断端桥接情况、骨密度以及新生骨矿化程度均优于对照组。值得注意的是，兔桡骨与尺骨在解剖上存在连续，因此在制备桡骨缺损模型后兔前肢的承重可由尺骨承担，桡骨在此期间可不参与负重，这与人体在骨缺损后的愈合过程可能存在不同。另外，兔的18 mm的骨缺损临界值与人的骨缺损临界值存在差异。

综上所述，HBC@TACS-pFGF2应用于骨缺损部位可以缩短骨缺损的愈合时间。实验中pFGF2质粒浓度为100 μg/mL，骨缺损修复的过程与pFGF2质粒的剂量有无关系，以及多种基因联合应用于骨缺损的修复效果如何，仍有待研究。另外，本实验采用明胶海绵作为缓释基因载体的负载材料，可用于非承重骨缺损的修复，应用于承重骨缺损处则存在一定缺陷。