一例红色斑点叉尾鮰出血病的病原分析

张超

摘要：为明确重庆万州某养殖场红色斑点叉尾鮰（Red Ictalurus punctatus）出血性败血症的病因，为该病的防治提供参考，采用细菌的分离纯化、生理生化试验、16S rDNA和gyrB基因测序、动物回归感染试验对病原进行了鉴定，并采用纸片扩散法进行了药敏试验。结果：从患病红色斑点叉尾鮰的内脏中分离获得1株优势菌，革兰氏染色呈阴性，一般单个或呈双存在，短杆状，两端钝而圆;菌落圆形，表面光滑湿润，边远整齐，β-溶血。能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇，不能分解阿拉伯糖、乳糖、纤维二糖;氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、吲哚试验、VP试验、七叶苷水解呈阳性;尿素酶、精氨酸双水解酶呈阴性。16S rDNA和gyrB基因测序结果与维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）同源性最高，分别达99%和100%;回归试验攻毒组与临床病例症状相似。药敏试验结果显示该菌对恩诺沙星、氟苯尼考、头孢西叮、头孢曲松、复方新诺明较为敏感。确定该例红色斑点叉尾鮰的主要病原为维氏气单胞菌。

关键词：斑点叉尾鮰;维氏气单胞菌;分离鉴定;药敏试验

斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus），亦称沟鲶（channel catfish），属鲶形目（Siluriformes）、鮰科（Ictaluridae），原产于美国密西西比河，是美国淡水养殖的主要品种[1]。1984年引入中国，具有适应性广、生长快、产量高、抗病力强、肉质上乘等优点，已在全国各地推广[2]。红色斑点叉尾鮰（Red Ictalurus punctatus），又称美国红鮰，简称红鮰，是自然变异的斑点叉尾鮰经长期改良选育而成的一个品种，色彩艳丽，集观赏美食于一体，市场推广前景更优于普通的斑点叉尾鮰[3]。然而，由于养殖密度过大，水质管理不当、药物使用不规范等原因，气单胞菌属（Aeromonas）致病菌导致的红鮰疾病在某些养殖场仍呈高发趋势，严重影响了红鮰产业的健康发展。2019年3月，万州某养殖场红鮰出现了以细菌性败血症并发“肠套叠”为典型症状的死亡，文章对该病例的病原进行了系统的分离鉴定并开展了药敏实验，旨在为该病的防治提供一定的参考。

1  材料与方法

1.1  实验材料

病料采集自万州某养殖场，健康斑点叉尾鮰（平均体长15.5±10 cm，平均体重35±5 g）购自当地水产品市场。培养琼脂培养基、革兰氏染色液、药敏检测试剂盒、细菌微量生化鉴定管均购于杭州天和微生物试剂有限公司，DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等均为宝生物（大连）工程有限公司产品，引物及基因测序由上海生物工程有限公司完成。

1.2  实验方法

1.2.1  细菌的分离纯化

取典型症状的病鱼，无菌操作取肝脏、脾脏、肾脏、脑划线接种于普通营养琼脂培养基上，置28℃恒温培养24 h，挑选形态一致的优势菌落，划线传代培养2次，纯化后的菌株转接到营养琼脂斜面培养基上，4℃冰箱保存备用[4]。

1.2.2  生理生化鉴定

细菌生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[5]所述方法进行。

1.2.3  16S rDNA和gyrB基因序列分析

使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待检菌株的DNA。16S rDNA基因PCR扩增引物参照分支杆菌[6]，反应条件略有改动。gyrB基因引物参参考Tac?o Marta [7]等，反应体系和条件同16S rDNA。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，胶回收后克隆到T载体上，送至上海生物工程有限公司进行测序，测序结果用NCBI-Blast进行在线序列比对。

1.2.4  回归感染试验

将市场上购买的60尾健康斑点叉尾鮰随机分为4组，2组为攻毒组，2组为对照组。调整菌悬液浓度至1.0×108 CFU/mL，攻毒组每尾胸鳍基部注射0.2 mL菌液，对照组注射0.2 mL的生理盐水。将试验鱼放置于水温为25℃的养殖箱中，每天观察并记录鱼的发病和死亡情况，持续时间为两周，同时对濒临死亡或已死亡的鱼进行剖检和病原菌的再次分离鉴定。

1.2.5  药敏试验

采用纸片扩散法。取浓度为1.0×108 CFU/mL的菌液0.2 mL均匀涂布于营养琼脂培養基上，28℃恒温培养箱中倒置培养24 h后观察并记录抑菌圈的直径，敏感性判定参照试剂盒说明书。

2  结果

2.1  临床症状

取池塘中患病斑点叉尾鮰进行剖检，可见肝肾脾等主要脏器出现不同程度的充血、出血，边缘张力明显，并有局部坏死，尤其是脾脏更为明显。可见肠道内充满淡黄色脓性分泌物，肠壁稀薄，炎症明显，同时可以观察到“肠套叠”。

2.2  细菌形态

分离菌株革兰氏染色呈阴性，一般单个或呈双存在，短杆状，两端钝而圆（图1）。菌落呈圆形，表面光滑湿润，边远整齐。在血平板上长势良好，有β-溶血现象。

2.3  生理生化特性

分离菌株能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇，不能分解阿拉伯糖、乳糖、纤维二糖。氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、吲哚试验、VP试验、七叶苷水解呈阳性，尿素酶、精氨酸双水解酶呈阴性。结合菌落和细菌形态观察，初步判定分离株为维氏气单胞菌[8]。

2.4  动物人工感染实验

每日观察并记录实验鱼状况，包括行为、症状和死亡情况。攻毒组斑点叉尾鮰在人工感染3 d后，出现活力下降，游动无力现象，体表和鳍条基部充血，5 d内发病鱼占攻毒总数的70%，而注射无菌生理盐水的对照组未见异常。可见表皮出血，全身各主要脏器充血肿大;再次分离到的菌株与原代菌株形态，生理生化和序列分析结果一致，说明分离株为该病例的致病病原。

2.5  基因扩增结果

16S rDNA测序后获得1505bp的基因片段，Blast结果与维氏气单胞菌的同源性最高，达99%;gyrB序列为198bp，与维氏气单胞菌同源性达100%（图2）。

2.6  药敏试验

分离株对10种抗菌药的敏感性差异比较大。对恩诺沙星、氟苯尼考、头孢西叮、头孢曲松、复方新诺明较为敏感，中度敏感的有苯唑西林、红霉素、卡那霉素，对青霉素G、克林霉素、氨苄西林表现为耐药。

3  讨论

细菌性败血症并发“肠套叠”为鮰鱼的临床常见症状，4～6月份高发，病程一般呈慢性经过，持续死鱼达10天以上，累积死亡率达50%左右。从全国来看，各地发病症状有所差异，分离鉴定的主要病原也不尽相同，可能性病原有鮰鱼爱德华氏菌、柱状屈挠杆菌、气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌四类[9]。维氏气单胞菌隶属气单胞菌属，为典型的条件致病菌，能侵染大多数的淡水养殖鱼类，尤其水质条件变差时，能引起鱼类大批死亡[10]。

10种抗菌药敏感试验显示，分离株对恩诺沙星、氟苯尼考、头孢西叮、头孢曲松等较为敏感，对青霉素G、克林霉素、氨苄西林等6种药物表现为耐药，与高金伟等[8]的结果不一致，这可是流行株的区域分布差异造成的。2019年9月中华人民共和国农业农村部发布了最新的《水产养殖用药明白纸》，水产上常用的三种抗菌药为恩诺沙星、氟苯尼考和复方磺胺甲噁唑（复方新诺明），本实验的结果表明分离株对这三种药物敏感，临床治疗上应优先选用这三种抗菌药。单纯的细菌性出血病在比较容易治疗，一旦诱发“肠套叠”，病程往往持续一个月以上，且治疗效果往往不理想。生产上应以综合防控为主：①定期检测水质，采用微生态制剂调水;②在开食或转食期间、疾病高发期间加强巡塘，做到对疾病的“早发现、早治疗”;③日常投喂严格遵守“三看、四定”原则;④定期开展鱼病检查。

参考文献

[1] 李林，严朝晖，肖友红.斑点叉尾鮰国内市场现状及产业发展前景浅析[J].中国水产，2012 （09）：35-36.

[2] 严朝晖，肖友红，李林.世界鲇鱼产业现状及对我国斑点叉尾鮰产业市场定位的重新认识[J].中国水产，2013 （06）：36-40.

[3] 乔燕平，张晨晨.红色和黑色斑点叉尾鱼回人工繁殖试验[J].水产科技情报， 2006（03）：118-120.

[4] 楊移斌，胥宁，董靖，等.斑点叉尾鮰病原中温和气单胞菌的分离鉴定及药敏特性分析[J].中国渔业质量与标准， 2017，7（04）：45-50.

[5]  东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社， 2001：114-116.

[6]  Ucko M， Colorni A， Kvitt H， Diamant  A ， et al. Strain variation in Mycobacterium marinum fish isolates[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（11）：5281-5287.

[7] Tac?o Marta， Alexandra M ， Artur A ， et al. Evaluation of 16S rDNA- and gyrB-DGGE for typing members of the genus Aeromonas[J]. FEMS Microbiology Letters，2005（246）：11-18.

[8] 高金伟，梁利国，王亚冰，等. 鳜源致病性维氏气单胞菌的鉴定及药敏试验[J]. 微生物学通报，2016，043（12）：2686-2692.

[9] 蔡焰值，雷晓中，汪亮，等. 斑点叉尾鮰重要疾病发病原因及预防措施[J].湖北农业科学，2010. 49（11）：2867-2871.

[10] 陈昌福.我们应该如何反思斑点叉尾鮰大量死亡的现象.[J].当代水产，2017.42（06）：77-78.