黄芩苷对慢性心肌衰竭大鼠心肌细胞凋亡及相关信号通路表达的影响

刘 宇,高 玲

0 引 言

慢性心力衰竭是各种功能性或器质性心脏病造成心室射血能力受损的一种综合征，具有较高的发病率和病死率，严重影响患者生活质量及威胁患者生命安全[1-3]。因此，采取及时有效的诊断和治疗慢性心力衰竭方法尤为重要[4]。研究报道显示，Akt/腺苷酸活化蛋白激酶(Amp-Activated Protein Kinase，AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路主要是自噬的经典通路，该通路的紊乱会导致一系列的疾病，包括自身免疫性疾病、肾病变，心脏病变等[5]。黄芩苷是从中药黄芩根茎中分离纯化的一种黄酮类单体化合物，具有抗细胞凋亡和抗氧化等多种生物学功能，在提高心肌功能和改善心肌缺血方面具有一定作用[6]。本文研究旨在探讨黄芩苷对慢性心肌衰竭大鼠心肌细胞凋亡及Akt/AMPK/mTOR信号通路表达影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和药物实验动物：雄性SD大鼠(SPF级)60只，体重(180±20)g，适应性饲养1周，每日给予12 h光照，控制相对湿度(55±2)%，控制温度(22±2)℃，动物饲料、饮用水和垫料均已消毒，大鼠来自北京维通利实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2016-0011。实验药物：黄芩苷(来自于西安昊轩生物科技公司，纯度99.8%)，氯沙坦钾片(购自浙江华海药业股份有限公司)，批号：1357L19001。

1.2 主要试剂和仪器主要试剂：心肌细胞凋亡试剂盒(来自于武汉博士的生物技术有限公司)；二步法TV6001免疫组化检测试剂盒及Bax、Bcl-2一抗(北京中杉金桥生物技术公司)；Akt、AMPK、mTOR mRNA单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)，引物设计及合成(上海生工生物工程公司股份有限公司)。主要仪器：SQ2125型石蜡切片机(徕克公司)，ABI-7300型实时荧光定量聚合酶链式反应(美国ABI公司)，Vevo 770高分辨小动物超声系统(Visual Sonics)。

1.3 方法

1.3.1 模型制备以腹主动脉缩窄法建立，大鼠经戊巴比妥钠腹腔注射(45 mg/kg)麻醉后，于大鼠腹部正中切口，分离肾动脉的腹主动脉长1 cm左右，以7号针头紧贴腹主动脉平行放置，结扎，将7号针头抽出，可使腹主动脉部分狭窄。术后给予10 000 U青霉素肌肉注射，1次/d，连续3 d。3周后，若出现失代偿性症状，即劳力性呼吸困难、心动过速和呼吸急促，且经彩色超声心动仪检测射血分数<45%，则体质慢性心力衰竭造模成功。除正常组，其余各组大鼠均造模成功。

1.3.2 实验分组及给药随机数字表法分为正常组、模型组、阳性对照组和实验组，每组各15只。阳性对照组给予氯沙坦钾片40 mg/kg灌胃， 1次/d；实验组给予黄芩苷50 mg/kg灌胃， 1次/d；正常组和模型组灌胃等剂量等渗盐水， 1次/d。各组灌胃4周。

1.3.3 心肌细胞病理形态学取大鼠心脏，以预冷等渗盐水冲洗。取部分左心室，取1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm大小的组织块置于10%甲醛固定48 h，HE染色，采用中性树胶封固，放入65 ℃烤箱中15 min，显微镜拍照。

1.3.4 心肌组织细胞指数(CAI)测定采用原位末端标记法检测。阳性染色细胞为有棕褐色颗粒。每张切片(随机选取5张)随机选取视野5个，计数100个心肌细胞，记录TUNEL阳性细胞总数，且以每100个细胞中阳性数为凋亡指数。

1.3.5 心肌Bax和Bcl-2蛋白表达按照二步伐TV6001免疫组化试剂盒说明标准操作，各组每个心肌标本连续切片，其中Bax和Bcl-2染色各取切片1张，棕褐色阳性颗粒主要表达于细胞浆，以计算机图像分析系统半定量分析，摄400×图像输入分析系统内，测定平均灰度值，其中每张切片选择无重叠视野5个，以灰度值大小作为蛋白的阳性表达指数。

1.3.6 心脏超声测定超声系统检测左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室舒张期内径(left ventricular end diastolic diameter，LVDEDD)、左心室收缩期内径(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)。

1.3.7Akt、AMPK、mTORmRNA测定提取RNA，测定RNA浓度，使用2 μg RNA逆转录，反应体系为50 μL。反应完成后，进行RT-PCT反应，具体引物序列(5′-3′)：Akt - TGTCTCGTGAGCGCGTGTTTT CCGTTATCTTGATGTGCCCGTC，产物长度159 bp；AMPK - GCGAAGGAAGAACCC TCACGGATGAGGTAAGAG，产物长度66 bp；mTOR - AGTGAAGCCGAGAGCAATGAGA GACAAGGAGATAGAACGGAAGAAGC，产物长度134 bp；GAPDH - CAACGGGAAACCCATCACCA ACGCCAGTAGACTCCACGACAT，产物长度96 bp。引物浓度0.3 μmol/L，cDNA使用2 μL，反应条件：95℃ 10 s变性，60 ℃ 32 s退火延伸，40个循环。反应结束后，测定CT值，内参采用GAPDH，以2-ΔΔCT分析mRNA相对表达量。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计分析，两组间计量资料采用独立样本t检验，多组间计量资料采用F检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组对心肌大鼠心肌细胞病理影像学影响光镜下观察，正常组大鼠心肌纤维结构清楚，横、纵纹正常，及细胞质正常；模型组大鼠心肌肌纤维增增粗，心肌细胞肥大，排列紊乱，且部分心肌细胞患者，伴不同程度炎症细胞浸润；阳性对照组大鼠心肌肌纤维排列紊乱，心肌纤维增粗，且部分心肌细胞肥大，以及伴部分炎症细胞浸润；实验组大鼠心肌纤维排列稍紊乱，少量心肌细胞肥大，以及伴少量炎症细胞浸润。见图1。

a:正常组； b:模型组； c:阳性对照组； d:实验组

图1 各组对心肌大鼠心肌细胞病理影像学影响(HE ×200)

Figure 1 Effect of each group on pathological imaging of myocardial cells in rats (HE staining ×200)

2.2 各组大鼠CAI比较与正常组比较，模型组、阳性对照组和实验组CAI升高(P<0.05)；而阳性对照组和实验组较模型组降低(P<0.05)。见表1。

2.3各组大鼠心肌Bax和Bcl-2蛋白表达比较与正常组比较，模型组、阳性对照组和实验组Bcl-2蛋白表达下降而Bax蛋白表达增加(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和实验组Bcl-2蛋白表达升高而Bax蛋白表达下降(P<0.05)；而阳性对照组和实验组Bcl-2和Bax蛋白表达比较无明显差异(P>0.05)。见表1。

组别nCAIBcl-2Bax正常组151.27±0.21149.83±14.32134.25±18.97模型组1565.38±7.89∗102.64±8.98∗218.73±15.42∗阳性对照组1523.69±7.53∗#133.73±12.10∗#163.29±23.15∗#实验组1525.05±8.91∗#135.62±10.87∗#162.10±27.36∗#

与正常组比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.05

2.4 各组大鼠心功能变化比较与正常组比较，模型组、阳性对照组和实验组LVEF下降而LVD和LVS增加(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和实验组LVEF升高而LVD和LVS下降(P<0.05)。见表2。

组别nLVEF(%)LVD(mm)LVS(mm)正常组1550.83±2.140.74±0.130.57±0.13模型组1534.25±2.87∗1.39±0.16∗0.96±0.12∗阳性对照组1539.25±2.01∗#1.15±0.14∗#0.78±0.10∗#实验组1542.34±1.90∗#△0.93±0.10∗#△0.69±0.12∗#△

与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与阳性对照组比较，△P<0.05

2.5 各组大鼠Akt、AMPK、mTOR mRNA表达比较与正常组比较，模型组、阳性对照组和实验组Akt、AMPK、mTOR mRNA表达降低(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和实验组Akt、AMPK、mTOR mRNA表达上升(P<0.05)；而阳性对照组和实验组Akt、AMPK、mTOR mRNA表达比较无明显差异(P>0.05)。见表3。

组别nAkt mRNAAMPK mRNAmTOR mRNA正常组151.001.001.00模型组150.54±0.09∗0.43±0.11∗0.67±0.08∗阳性对照组150.79±0.10∗#0.68±0.17∗#0.80±0.09∗#实验组150.78±0.12∗#0.71±0.19∗#0.82±0.05∗#

与正常组比较，*P<0.05； 与模型组比较，#P<0.05

3 讨 论

慢性心力衰竭主要是由于多种原因导致的射血能力受损或心室充盈的复杂的一种临床症候群，具有病情发展、发病率高等特点，是全球面临的重大医疗问题之一[7-10]。因此，临床上采取及时有效的诊断和治疗慢性心力衰竭方法尤为重要。黄芩苷主从黄芩根茎中分化纯化的一种黄酮类单体化合物，药理研究发现黄芩苷具有多种生物活性，如抗过敏、抗凋亡和抗氧化作用、抑菌作用及增强机体免疫力作用等[11]。此外研究发现，黄芩苷用于多种心血管疾病中发挥良好作用，可减少心肌细胞的凋亡，且具有保护心脏损伤大鼠心脏作用[12-13]。本文研究结果显示，与模型组比较，阳性对照组和实验组CAI降低，阳性对照组和实验组LVEF升高而LVD和LVS下降，由此提示黄芩苷可抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌损伤。细胞凋亡主要是遗传基因控制的细胞自主性死亡过程，是机体不再需要的细胞及癌变细胞的自身防御性机制、清除严重受损的细胞，包括Bcl-2家族蛋白的调控等机制。Bax和Bcl-2是调控心肌细胞的关键凋亡基因，并且两者比例决定心肌细胞在受凋亡刺激后是存活还是死亡。慢性心力衰竭时存在广泛的心肌细胞凋亡，其中Bcl-2表达明显降低而Bax表达明显升高。本文研究结果显示，模型组比较，阳性对照组和实验组Bcl-2蛋白表达升高而Bax蛋白表达下降，由此提示黄芩苷可上调Bcl-2表达而下调Bax表达。

Akt/AMPK/mTOR信号通路是细胞中关键生存信号通路，参与调节细胞增殖、分化、凋亡等活动，以往多用于癌症细胞的迁移过程[14]。最近的数据已经表明，mTOR信号通路参与肾脏疾病发病机制如急性肾损伤、糖尿病性肾病和多囊肾疾病[15]。在糖尿病肾病mTOR通路激活是与间质纤维化，肾小管萎缩和肾小球滤过率逐渐下降密切相关，阻断mTOR信号通路将会延缓糖尿病肾病进展。但目前临床上尚无有关Akt/AMPK/mTOR信号通路与慢性心力衰竭方面研究。AMPK主要参与调节细胞代谢，其活性主要由AMP/ATP比例控制，保持机体能量平衡。同时，AMPK可参与调节胰岛β细胞分泌胰岛素的末端缓解，并且在胰岛β细胞内，葡萄糖能够通过氧化代谢改变细胞内的腺苷酸水平，进一步影响AMPK活性。目前，尚无有关AMPK与慢性心肌衰竭方面研究，但认为心力衰竭时心肌能量代谢出现“胚胎化”，而胚胎化主要是指胚胎发育阶段心肌细胞能量供应来源于乳酸氧化和糖酵解，故而认为AMPK可能与慢性心力衰竭发病相关[16]。本文通过初步研究发现，与模型组比较，阳性对照组和实验组Akt、AMPK、mTOR mRNA表达上升，由此提示黄芩苷可上调Akt/AMPK/mTOR信号通路表达，但具体机制尚未十分明确，还需在后续中深入研究。

综上所述，黄芩苷可减轻慢性心肌衰竭大鼠心肌损伤，其作用机制可能与上调Akt/AMPK/mTOR信号通路表达有关，具有重要研究价值，值得进一步深入研究。