RNA转运蛋白及其在肿瘤中的表达与功能

胥米米，聂妙婷综述，杨敏慧审校

0 引 言

据国际癌症研究中心统计，2018年全球约有1810万恶性肿瘤新发病例及960万死亡病例[1]。恶性肿瘤发病率、死亡率迅速增长，已成为威胁人类健康的重要因素。随着二代测序技术的发展，我们发现越来越多的RNA分子在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。多数RNA分子常富集于肿瘤细胞的特定区域，不同的细胞亚定位，决定了其不同的生物学功能。通常，RNA分子无法自由通过核膜，其功能的发挥常需经历RNA核浆穿梭过程，即RNA转运，此过程需要多种RNA转运蛋白(RNA transport protein)协助。RNA转运蛋白失调，常导致下游关键RNA分子细胞亚定位及表达水平的变化，与多种肿瘤的发生发展密切相关。因此探究肿瘤相关RNA转运蛋白及其作用机制是目前恶性肿瘤研究的重要课题之一。研究发现，RNA转运蛋白主要包括：转运适配蛋白、转运受体蛋白、转运调节蛋白Ran及核孔蛋白[2]。本文围绕RNA转运蛋白及其在肿瘤中的表达与功能展开综述，阐述此类分子独特的生物学功能及其与肿瘤发生发展的关系，为发掘新型肿瘤标志物和治疗靶点提供理论依据。同时，通过调研文献发现该领域的研究重点和不足，为进一步探索RNA转运蛋白在肿瘤发生发展中的作用提供新思路。

1 RNA转运蛋白与RNA核浆转运

核膜将细胞划分为细胞核与细胞质两大相对独立又相互联系的区域，既避免了核质间生化反应的相互干扰，使细胞生命活动秩序井然；同时又作为屏障控制着核质间的物质交换，影响各关键分子，特别是RNA分子的细胞亚定位及功能。其中，位于核膜上的核孔复合体(nuclear pore complex，NPC)，是相关分子进出细胞核的关键通道[3]。通常，RNA分子无法自由通过NPC，需要RNA转运蛋白的协助：首先，转运适配蛋白识别并结合于靶RNA的特定信号序列，形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)，又称为转运适配复合体；其次，在转运调节蛋白的参与下，转运受体蛋白识别并结合RNP中适配蛋白的特定信号序列，形成三聚体，即核转运复合物(nuclear transport complex，NTC)[4]；随后，NTC与核孔蛋白结合并通过NPC中央通道，实现核浆转运；最后，NTC将靶RNA运输至细胞特定亚位点，释放各转运蛋白。研究发现，上述转运蛋白的表达、定位异常或功能失调与多种肿瘤密切相关，其通过改变相关分子的核浆转运效率、降低胞浆mRNA衰变率或激活下游信号通路等方式影响肿瘤的形成、局部浸润和远处转移。见图1。

a:RNA的核输出转运; b:RNA的核输入转运

图 1 RNA的核浆转运与肿瘤发生发展的相关性

Figure 1 RNA transport and their roles in development of tumors

1.1转运适配蛋白

1.1.1 转运适配蛋白介导靶RNA与转运受体蛋白的识别与结合转运适配蛋白(transport adaptor proteins)是一种特殊的RNA结合蛋白[2,5]，是RNA 核浆转运的首要分子基础，其上具有识别结合靶RNA的RNA结合域及能被转运受体蛋白识别的疏水信号，即核输出信号(nuclear export signal，NES)和核定位信号(nuclear localization signal，NLS)[4,6]。研究发现，人抗原R(human antigen R，HuR)是一种转运适配蛋白，可识别核内的线粒体RNA处理核糖核酸内切酶RNA组分(RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease，RMRP)并结合转运受体蛋白核输出蛋白-1(Chromosomal region maintenance1，CRM1)，形成核转运三聚体，进而实现RMRP的核输出，随后RMRP进入线粒体，促进线粒体DNA的复制和加工[5,7]。综上，转运适配蛋白作为RNA转运过程的起始分子，介导靶RNA与转运受体蛋白的识别与结合。

1.1.2转运适配蛋白在肿瘤中的表达及功能研究发现，转运适配蛋白不仅协助RNA核浆转运，还在保护细胞质mRNA中发挥重要作用。例如，HuR在不同肿瘤及肿瘤的各个阶段具有不同的细胞表达定位，参与细胞质mRNA保护，促进多种肿瘤的发生发展。在结直肠癌中，HuR异常高表达，主要定位于细胞质[8-9]，而在癌周正常细胞中，HuR则主要定位于细胞核。Young等[9]发现，细胞质中异常高表达的HuR可竞争性抑制三肽脯氨酸与环氧化酶-2 mRNA 3′-UTR的腺嘌呤核苷酸-尿嘧啶核苷酸富集元件(adenylate-uridylate rich element，ARE)结合，从而减少mRNA的衰变，促进翻译，增加环氧化酶-2蛋白表达水平，提高细胞生长和增殖能力，最终促进结直肠癌的发生与发展。胞质HuR异常高表达导致环氧化酶-2的表达水平增高的现象在口腔鳞状细胞癌的发生和转移中也有被发现[10]。此外，HuR还可增加细胞周期蛋白A、表皮生长因子受体、血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子-α等mRNA的细胞质内稳定性，提高蛋白表达水平，导致细胞生长增殖失调、侵袭性增强，促进肿瘤的发生与演进[8-9,11]。反之，miR-155-5p可靶向抑制HuR的表达，降低上述mRNA的稳定性，抑制结肠癌的增殖和转移[8]。在乳腺癌中，HuR在细胞质内异常高表达与患者化疗抵抗、预后不良密切相关[12]。Zhang等[12]发现在乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞株中，HuR可直接与细胞周期蛋白依赖性激酶3(cyclin-dependent kinases 3，CDK3)mRNA相互作用，降低CDK3 mRNA的衰变率，抑制细胞凋亡[12]。HuR还可能通过白介素-8 mRNA的3′-UTR的ARE抑制白介素-8的表达，促进食管癌的发生和发展[13]。综上所述，HuR既可作为转运适配蛋白协助RNA的核浆穿梭，又可通过与下游基因mRNA3′-UTR的ARE相互作用，降低mRNA衰变率。调研文献发现，转运适配蛋白在肿瘤中的相关研究主要集中在对细胞质mRNA的保护方面，其参与的RNA核浆穿梭过程与肿瘤的关系研究甚少。然而大部分参与细胞生命活动的RNA，如miRNA、lncRNA等[14-15]，常需出核发挥调控作用，因此我们推断转运适配蛋白介导的RNA转运失调势必在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，此假说有待证实。

1.2转运受体蛋白

1.2.1 转运受体蛋白是核转运三聚体的关键中间分子转运受体蛋白可分为核输出蛋白与核输入蛋白。其中，核输出蛋白特异性识别并结合具备NES的适配复合体，介导靶RNA分子的核输出；核输入蛋白则识别具备NLS的适配复合体，协助靶RNA分子核输入[2,5]。转运受体蛋白包含3个结构域：C端RNP结合域、N端转运调节蛋白结合域及核孔蛋白结合域[2,4,6,16]。因此，转运受体蛋白可与RNP及转运调节蛋白Ran结合，组成核转运三聚体，参与RNA的核浆转运。2018年，有研究发现RNA转运受体蛋白CRM1参与mRNA、rRNA、lncRNA和miRNA等多种RNA分子的转运[2,4]。其中，CRM1可通过其具有活性位点Cys528的疏水凹槽与适配蛋白的NES结合。研究表明，CRM1参与40S、60S前体核糖体亚基的核输出。CRM1与核输出蛋白-5共同作为转运受体蛋白，协同核糖体输出适配蛋白NMD3，实现人类60S前体核糖体亚基的核输出[17-18]。CRM1对于40S前体核糖体亚基的转运则需要核糖体蛋白S15的协助[19]。此外，如前所述，CRM1可与转运适配复合体HuR- RMRP结合，协助RMRP转运出核[5,7]。CRM1还协助CD83 mRNA的出核转运，提升CD83蛋白表达水平，促进树突状细胞的分化成熟[20]。Xie等[21]发现CRM1在某些5′末端具有7-甲基二鸟苷三磷酸(7-methylguanosine，m7G)帽的前体miRNA核输出中同样发挥作用，例如在具有m7G帽的前体miR-344核输出时，CRM1被磷酸化RNA输出适配体PHAX招募并锚定在前体miR-344上，介导前体miR-344的核输出。故转运受体蛋白作为RNA转运过程中的关键分子，决定着RNA的转运方向并在转运三聚体的形成中发挥主要作用。

1.2.2转运受体蛋白在肿瘤中的表达及功能研究发现，转运受体蛋白不仅参与RNA核浆穿梭，还协助多种蛋白质的核浆转运。例如，CRM1异常表达，可导致多种靶蛋白转运失调，进而促进肿瘤的发生发展[22-23]。Shao等[22]发现在卵巢上皮性肿瘤中，CRM1表达显著高于正常组织，其异常高表达可促进雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)出核，使mTOR在细胞质中过量积累，从而激活mTOR-STAT3信号通路，促进卵巢上皮性肿瘤的转移。反之，苯基异硫氰酸盐可嵌入CRM1的疏水凹槽，阻断CRM1与mTOR的识别结合，导致mTOR的核滞留，抑制下游效应蛋白——信号转导与转录激活因子-3(signal transducer and activators of transcription 3，STAT3)ser727位点的磷酸化，从而抑制mTOR-STAT3通路活性，抑制卵巢上皮性肿瘤的转移[22,24]。此外，Shen等[25]发现在神经胶质瘤中，随肿瘤WHO分级增高，CRM1表达水平不断升高，而CRM1高表达，会有大量细胞周期抑制蛋白p27的ser10位点发生磷酸化并输出至细胞质，致细胞核中未磷酸化的p27显著减少，活化细胞周期依赖性激酶，促进细胞周期G1/S转换，导致细胞增殖失调，促进神经胶质瘤的发生。此外，CRM1还在结直肠癌细胞中异常高表达。细胞体外功能试验证实，CRM1过表达可增强结直肠癌细胞株HCT-15、HCT-29的增殖和克隆形成能力[26]。在胃癌中，CRM1与细胞周期蛋白依赖性激酶-5(cyclin-dependent kinases 5，CDK5)协同表达，二者表达水平与胃癌的原发灶大小、分化程度、TNM分期等临床病理参数密切相关，故认为CRM1和CDK5的共表达状态可作为胃癌患者总体生存率的独立预后因素[27]。Gao等[28]发现，异常高表达的CRM1在亚硝胺类物质相关肺癌的发生发展中也发挥重要作用。目前，转运受体蛋白在肿瘤中功能的研究主要集中在靶蛋白核浆转运失调方面，缺乏其介导的RNA转运失调对肿瘤的影响的相关研究，深入探讨该问题，或将为探索肿瘤演进的分子机制提供新思路。

1.3转运调节蛋白Ran

1.3.1 转运调节蛋白Ran调节转运蛋白间的亲和力，并为转运过程供能转运调节蛋白Ran，又名Ras相关核蛋白(Ras-relasted nuclear protn，Ran GTPase/Ran)，是一种小分子尿苷三磷酸酶(GTPase)[2,5]。与其他GTPase相似，Ran以GTP和GDP两种结合形式存在，在细胞核、质中不对称分布，通常细胞核中Ran-GDP可转化为Ran-GTP，细胞质中Ran-GTP水解为Ran-GDP[4,16,29]。研究证明，Ran可调控转运受体蛋白与适配复合体的亲和力，约50～100倍[30]。通常，在核输入过程中，当核输入复合体穿过NPC后，Ran-GTP与核输入蛋白结合，使适配蛋白和靶RNA解离[16,31]；同时，Ran-GTP随核输入蛋白进入细胞质，而后在特定酶的作用下，Ran-GTP水解为Ran-GDP并从核输入蛋白上解离，最终返回细胞核并再次转化为Ran-GTP，等待下一次转运。相反，在核输出过程中，细胞核中Ran-GTP结合于核输出蛋白可增强其与适配复合体的亲和力，二者穿过NPC到达细胞质后解离，导致靶RNA和其他转运蛋白的释放。显然，Ran-GTP在胞浆中的水解反应既为整个转运过程提供了热力学动力，也使转运三聚体的解离反应不可逆[4,17]。值得关注的是，在转运过程中，转运调节蛋白Ran、转运适配蛋白和转运受体蛋白均可被循环利用[16]；Ran GTPase系统及转运受体蛋白类别是核浆转运方向的决定性因素。

1.3.2转运调节蛋白Ran在肿瘤中的表达及功能研究发现，转运调节蛋白Ran还在多种蛋白质的表达和转运中发挥作用，影响多种肿瘤的分化、浸润和转移。Vaidyanathan等[32]发现，Ran在乳腺癌中高表达，诱导肿瘤发生及恶变。作为一种强烈的染色体不稳定相关标志物，Ran高表达可导致pRb、p53、p73、p21、p27、E2F4、IκB、乳腺癌易感基因1和存活素等分子的过度核输出，从而促进肿瘤的恶性演进[32]。Haggag等[33]设计出一种纳米包封的抗Ran GTPase多肽，它可在乳腺癌细胞株MDA-MB-231中封闭Ran，从而诱导细胞凋亡，延缓肿瘤进展。研究表明，Ran在较高分级、分期的卵巢上皮性肿瘤中异常高表达，促进肿瘤细胞增殖，抑制凋亡。在侵袭性卵巢癌TOV112D和TOV1946细胞株中，干扰Ran的表达可促进胱天蛋白酶-3的表达，导致肿瘤细胞凋亡[34]。此外，Deng等[35]发现Ran在胰腺癌淋巴转移样本中表达量明显高于其在原发肿瘤中的表达量，导致雄激素受体和趋化因子受体表达水平上调，增强肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移能力[35]。在食管癌中，Ran异常高表达，导致靶基因miRNA-203表达水平相应下调，促进肿瘤的增殖、侵袭和迁移。此外，Ran在结直肠癌中显著高表达，与患者生存预后不良密切相关[36]。调研文献发现，Ran在肿瘤中的研究主要集中于其对蛋白质核浆转运的调控方面，尚缺乏其参与的RNA核浆穿梭在肿瘤发生发展中作用的相关研究。Ran介导的RNA转运失调对多种肿瘤的影响或将成为肿瘤研究的新方向。

1.4核孔蛋白

1.4.1 核孔蛋白协助核转运三聚体通过核孔核孔复合体是RNA分子核浆穿梭的“交通枢纽”，由多种核孔蛋白(nucleoporins，NUP)组成，控制各种分子的核浆转运[3,37]。核孔蛋白根据有无苯丙氨酸-甘氨酸重复序列(FG结构域)分为：FG型核孔蛋白和非FG型核孔蛋白。约1/3为FG型核孔蛋白[3,38]，如Nup98、Nup214、Nup358等，主要位于NPC的中央通道附近，识别特定信号，实现选择性物质转运[39]。在RNA核浆穿梭中，FG结构域可被核转运三聚体中的转运受体蛋白识别结合，进而介导其通过NPC中央通道。多数核孔蛋白为非FG型，主要定位于NPC的外周，协同FG型核孔蛋白，实现相关分子的核浆转运[39]。研究表明，NUP88正是非FG型核孔蛋白，它能与FG型核孔蛋白NUP214形成NUP88-NUP214复合体[40]，参与CRM1介导的核输出[38,40]。此外，核孔蛋白还参与纺锤体装配、着丝点形成，影响染色体分离、基因表达、有丝分裂和细胞生长等过程[37]。

1.4.2核孔蛋白在肿瘤中的表达与功能核孔蛋白既参与细胞内分子的核浆转运，也调控细胞生长和增殖，在多种人类疾病中扮演重要角色。核孔蛋白的异常表达、定位及其染色体突变易位常与肿瘤的发生发展密切相关[41-45]。核孔蛋白染色体易位已被证实是白血病发生过程中的重要环节[41]。在急性髓性白血病中，FG型核孔蛋白NUP98可通过染色体易位的方式，与同源转录因子HOXA9形成嵌合蛋白，使下游基因转录失调，诱发细胞增殖及分化障碍，促进白血病的发生，上述现象常标志着预后不良[41-42]。此外，非FG型核孔蛋白NUP88在胃肠肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌和黑色素瘤等中异常高表达[43-45]，其高表达往往导致NUP214的错误定位，减弱对CRM1的招募作用，导致CRM1滞留于细胞质，从而降低相关转录调控因子的核输出效率，促进细胞的生长与增殖[38]。另有研究证实， 与癌周正常组织相比，NUP88的表达情况与结直肠癌的淋巴转移及TNM分期相关，患者血清NUP88水平与肿瘤的浸润深度呈正相关[43-44]。在前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、肺癌中，NUP88异常高表达或伴异常定位，其表达水平随肿瘤恶性程度增高而升高[44,46]。调研文献发现，目前肿瘤中核孔蛋白的相关研究，主要集中在突变导致的嵌合蛋白形成及影响转录相关因子转运效率方面，其异常表达导致的RNA转运失调在肿瘤发生发展中作用的研究尚不足，深入探究此问题，将有助于开拓肿瘤研究的新领域。

2 研究现状、局限及原因分析

综上，RNA转运过程主要涉及转运适配蛋白、转运受体蛋白、转运调节蛋白Ran及核孔蛋白——它们通过特殊的信号序列相互识别并结合，协助RNA分子的核浆穿梭，耦联细胞核、质中的生命活动。此外，某些RNA转运蛋白还参与细胞质mRNA保护、蛋白质核浆转运、纺锤体装配、着丝点形成等。其中，HuR、CRM1、Ran、NUP88等RNA转运蛋白参与细胞的生命周期调控，并已经在肿瘤诊断、治疗和随访中显示出巨大潜力。例如，CRM1已被证实是一种有效的肿瘤治疗靶点，其靶向抑制剂将得到广泛应用；NUP88则已作为一种肿瘤标志物，应用于临床实践；此外，HuR和Ran或将成为新型肿瘤标志物或治疗靶点。

同时，我们发现目前有关RNA转运蛋白失调在肿瘤发生发展中作用机制的研究主要集中在以下三方面：①转运适配蛋白HuR异常高表达可降低细胞质中多种与生长、增殖及恶变有关的mRNA衰变率，提高蛋白表达水平，促进肿瘤发生与恶性演进；②转运受体蛋白CRM1、转运调节蛋白Ran或核孔蛋白的失调均可影响靶蛋白转运，改变下游信号通路活性，促进肿瘤进展；③核孔蛋白还可因染色体突变易位与转录调控因子形成嵌合蛋白，导致转录失调，促进恶性肿瘤的发生发展。目前，尚缺乏有关RNA转运蛋白介导的RNA核浆转运失调与肿瘤发生及演进的相关研究。

此外，我们注意到目前肿瘤相关分子的研究主要集中在编码分子中，对RNA，特别是非编码RNA的研究较少。其次，一些研究提出RNA转运蛋白的异常可通过介导靶蛋白异常转运或稳定细胞质mRNA，促进肿瘤进展。但其中大部分研究并未阐明相关mRNA转运是否发生相应变化，所以目前有关RNA转运蛋白失调导致的RNA表达定位异常在肿瘤中功能的研究甚少，机制尚不明确。另外，目前肿瘤相关分子机制研究多集中在RNA表达水平、RNA表达调控及对下游分子的影响等方面，关注RNA细胞亚定位及调控的研究少之又少，然而大部分参与细胞生命活动的RNA，如microRNA、lncRNA和snRNA等，其定位直接影响功能的发挥，因此，深入探究此问题有助于认识RNA分子的细胞亚定位与肿瘤发生发展的关系，开拓肿瘤分子机制研究的新领域。

3 结语与展望

目前RNA转运蛋白的相关研究较少，其表达变化、生物功能、调控机制及临床价值有待进一步探究和完善。相信随着研究的深入和新技术的运用，我们会更全面地认识RNA转运相关蛋白。深入研究其在肿瘤中的表达及功能，探明下游信号通路，阐明其独特生物学功能及与肿瘤发生发展的关系，将为新型肿瘤标志物、治疗靶点的发现和临床应用指明方向，为肿瘤诊断、治疗和随访等提供新的思路。