生产工艺对博落回口服液质量稳定性影响研究

郁建生，郁建平，胡美忠，梁 浩，钱玺丞，吴 浪

(1.铜仁职业技术学院药学院,贵州铜仁 554300； 2.民族中兽药分离纯化技术国家地方联合工程研究中心,贵州铜仁 554300；3.贵州大学生化营养研究所,贵阳 550025)

中药博落回又名号筒杆，勃勒回，山梧桐等，系罂粟科植物博落回[Macleayacordata(willd) R.B]的带根全草入药，广泛分布于长江流域以南各省，特别是云、贵、川较多见，遍生于荒山野坡，随处可见，并可人工种植。民间用其治疗痈肿疔毒，恶疮溃疡，烫伤顽癣、风湿痹症、跌打损伤、疥疮等体表疾患，因其大毒，不作内用[1]。现代医学研究表明，博落回的有效药用成分为生物碱，也提取分离出血根碱(sanguinarine)、白屈菜红碱(chelerythrine)、博落回碱(bocconoline)、原阿片碱(protopine)、别隐品碱(allocryptopine)、小檗碱(berberine)等多种，均属异喹啉类生物碱[1-2,6]。博落回生物碱是一种具有抗菌消炎、清热解毒、增强免疫功能、抑制多种病原菌、抗病毒、抗肿瘤等多种功效作用，广泛用于人、畜多种感染性疾病治疗[3-5]。

提取博落回生物碱(主要有血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱)后将其制成口服液用以治疗仔猪下痢、家禽肠炎等畜禽消化道疾病取得较好效果[4，6]，试验表明，采用液体口服给药，药物直接进入胃肠道对肠道疾病效果好，口服液给药一是能极大的方便投药，节约大量人力物力，特别适合规模化养殖防控用药，二是生产工艺简化，降低生产成本，是博落回兽药产品中值得研究开发的一种新制剂。由于血根碱、白屈菜红碱分子中含有不稳定的环氧基、芳香季胺等基团，影响其生物碱的稳定性[7]，而博落回生物碱质量稳定性直接影响着口服液的质量稳定性。稳定性是保证口服液质量及有效期时间的重要技术指标。为了更好的考察博落回生物碱类化合物在口服液中的稳定性，本研究进行了口服液质量稳定性试验。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验用博落回果均采自贵州省松桃县大兴镇大兴村同一地点，由铜仁职业技术学院兽药研究所进行鉴定及采用统一的干燥方法加工制样。

博落回口服液由铜仁职业技术学院兽药研究所、民族中兽药分离纯化技术国家地方联合工程研究中心研制，铜仁民族兽药厂生产。由博落回果荚经提取有效成分生物碱后精制而成(成品每毫升含有效成分总生物碱不低于5 mg)。

1.2 实验试剂 标准品血根碱(sigma,98%),白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱、小檗碱均为上海源叶生物科技有限公司产品、纯度大于98%，HPLC用试剂乙腈为色谱纯，其它试剂：H2SO4、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、NaHSO3、NaSO3、EDTA、吐温-80等均为分析纯，乙醇为95%食用酒精。

1.3 实验仪器 Agilent1290高效液相色谱仪(安捷能科技有限公司)，TU—1901紫外可见分光光度计(北京普析)，50/100 mL玻璃反应釜(上海普渡生化科技有限公司)，RE—52旋转蒸发仪(上海亚荣)，PHSJ—3F精密酸度计(上海雷磁)，电子天平(美国奥豪斯)，LC-3000药物稳定实验箱(上海医疗器械厂)，微高压药汁提取机(上海泰压格)，ALG5/100自动灌装封口机(上海国彩)，液体自动混合机(北京长安仪器厂)，鼓风干燥箱(上海实验仪器厂)，植株样本粉碎机(上海实验仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 博落回生物碱含量测定方法 博落回总碱及血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱含量采用高效液相色谱法测定，色谱条件(色谱柱为C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.2%三乙胺溶液与乙腈，测定波长271 nm)、对照品溶液制备、供试品溶液制备、测定方法等均按农业部兽药评审中心主编的“兽医质量标准汇编”(2006-2011年)方法进行测定[2,8]。

博落回总生物碱得率=博落回总生物碱质量/博落回果荚质量×100%，博落回生物碱单体得率=博落回生物碱单体质量/博落回总生物碱质量×100%[9]。

1.4.2 博落回口服液生产工艺[10,11]由博落回果荚经提取有效成分生物碱后精制而成。采用液体生产法，经正交试验优选生产工艺如下： 取博落回果荚制粗粉过40目筛后精密称取1 kg放入反应釜，用85%酸性乙醇60 ℃保温搅拌浸提二次(每次1 h，乙醇用量为药材量8-10倍)，冷却，合并醇浸提液过滤，滤液减压回收乙醇，得浓缩液(含醇量30%)，冷却过滤，滤液用10%H2SO4调PH4-5后加热至90～100 ℃保持10～20 min后减压回收乙醇至尽，冷却过滤，加入口服液总量1.5%的吐温-80及口服液总量5%的葡萄糖，加口服用水至足量，调PH，精滤，灌装、熔封、摄氏100度流通蒸汽灭菌30 min即得(使成品每毫升含有效成分总生物碱不低于5 mg，含葡萄糖不低于5 mg)。

1.4.3 不同提取工艺对博落回口服液质量稳定性影响 取干燥后博落回果荚粗粉粹过40目筛备用，精密称取处理好的博落回果荚干燥粗粉各五份，每份1 kg，分别采取酸水浸提法、乙醇浸提法、酸性乙醇浸提法提取博落回生物碱，各得提取液500 mL,按1.4.1 法测定总生物碱及血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱含量。

1.4.4 不同乙醇浓度对博落回口服液质量稳定性影响[2,11]精密称取处理好的博落回果荚干燥粗粉七份，每份100 g，分别置1000 mL三角瓶中，对应加入浓度分别为30%，40%，60%、70%，70%，80%，90%的乙醇100 mL后于电动震荡机上，頻率120次/min，间隔振摇2 h后滤出，定容，按1.4.1 法测定总生物碱及血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱含量。

1.4.5 灭菌对博落回口服液质量稳定性影响[11]取按1.4.2法制成的口服液三批，每批500 mL，按1.4.1法测定灭菌前后博落回总生物碱及血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱含量及博落回口服液在不同的温度、时间下存放后生物碱含量变化。

1.4.6 不同 pH值对博落回口服液质量稳定性的影响[11]取处理好博落回果荚干燥粗粉，按1.4.2方法制成口服液，分取口服液八份，每份50 mL，分别用4%NaOH液及10%H2SO4液调不同的pH值后制成口服液，100℃灭菌30 min，按1.4.1方法测定总生物碱及血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱含量。

1.4.7 不同附加剂对博落回口服液质量稳定性的影响[11]取处理好博落回果荚干燥粗粉，按1.4.2方法制成口服液，分取口服液八份，每份50 mL，分别加入不同的附加剂(加入量EDTA为0.01%，其余均为0.2%)后制成口服液，100℃灭菌30 min，按1.4.1方法测定总生物碱及血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱含量。

2 结果与分析

2.1 血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱的测定 见下图1、图2

2.2 不同提取工艺对博落回口服液质量稳定性影响 见下图3。

(从左到右 原阿片碱，别隐品碱，血根碱，小檗碱，白屈菜红碱)图1 博落回提取物对照品HPLC图Fig 1 HPLC of Macleaya cordata extract reference substance

(从左到右 原阿片碱，别隐品碱，血根碱， 白屈菜红碱)图2 博落回口服液样品HPLC图Fig 2 HPLC of sample of oral liquid made Macleaya cordata

图3 不同提取工艺对博落回口服液质量稳定性影响Fig 3 Effect of different extraction process on the quality and stability of oral liquid made Macleaya cordata

由图3可知：不同提取工艺对生物碱浓度影响较大，生物碱浓度以酸性乙醇浸提法最高，总碱提取率可达到11.6%，血根碱提取率4.8%，白屈菜红碱提取率1.73%，原阿片碱提取率达3.85%，别隐品碱提取率1.92%。生物碱浓度从小到大顺序为沸水提取法﹤酸水浸提法﹤乙醇浸提法﹤ 酸性乙醇浸提法。

2.3 乙醇浓度对博落回口服液质量稳定性影响，结果见下图4。

图4 乙醇浓度对博落回口服液质量稳定性影响Fig 4 Effect of ethanol concentration on the quality and stability of oral liquid made Macleaya cordata

由图4可知：90%的乙醇对博落回总生物碱提取率均在9.65%，血根碱提取率3.40%，白屈菜红碱提取率1.44%，原阿片碱提取率3.20%，别隐品碱提取率1.60%。乙醇浓度越高, 博落回生物碱提取率越高, 效果越好,质量越稳定。

2.4 灭菌对博落回口服液质量稳定性影响 博落回口服液100℃灭菌前后生物碱质量变化，见下表1。

从表1可见，灭菌后三批口服液样品总生物碱含量平均下降0.15 mg/100 mL，占总量的2.8%；血根碱含量平均下降0.06 mg/100 mL，占总量的3.1%；白屈菜红碱含量平均下降0.02 mg/100 mL，占总量的2.8%；原阿片碱含量平均下降0.05 mg/100 mL，占总量的2.8%；别隐品碱含量平均下降0.02 mg/100 mL，占总量的2.2%，变化小是非常稳定的。

表1 博落回口服液灭菌前后质量稳定性变化Tab 1 The changes of quality stability of oral liquid made Macleaya cordata before and after sterilization

2.5 不同 pH值对博落回口服液质量稳定性的影响 不同 pH值对博落回口服液质量稳定性的影响结果见下图5。

图5 不同 pH值对博落回口服液稳定性影响Fig 5 Effect of different pH value on the stability of the oral liquid made Macleaya cordata

由图5可知：口服液的pH值在5时博落回总生物碱浓度在6.32%，血根碱浓度2.23%，白屈菜红碱浓度0.94%，原阿片碱浓度2.09%，别隐品碱浓度1.05%。口服液pH值在4时血根碱浓度2.86%，以pH值在4～6时生物碱含量最高，最稳定。

图6 不同添加剂对博落回口服液质量稳定性影响Fig 6 Effect of different additives on the quality and stability of oral liquid made Macleaya cordata

2.6 不同附加剂[8]对博落回口服液质量稳定性的影响 由图6可知：硫代硫酸钠、亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠对总生物碱的质量稳定性影响较大，可使总生物碱质量降低0.37～0.67 mg/100 mL，血根碱浓度降低0.02～0.22 mg/100 mL，白屈菜红碱浓度降低0.06～0.1 mg/100 mL，原阿片碱浓度降低0.13～0.23 mg/100 mL，别隐品碱浓度降低0.06～0.11 mg/100 mL，在生产中应避免使用；而EDTA、吐温-80、Vc、亚硫酸氢钠等附加剂对总生物碱质量稳定性影响甚小，适合选用。

3 讨论与结论

目前，以天然植物博落回所含生物碱类为原料研发生产的兽药制剂有博落回注射液、博落回散等，但博落回口服液尚无产品上市，博落回制剂是一种纯天然绿色兽药产品，用以治疗仔猪下痢、家禽肠炎等畜禽消化道疾病及促进猪、鸡生长取得较好效果[4,6]，更是当前“替抗”产品的优秀品种。试验表明，采用口服给药，药物直接进入胃肠道对肠道疾病效果好，口服液给药能极大的方便投药，节约大量人力物力，特别适合规模化养殖防控用药，是一种值得研究开发的博落回兽药新制剂。本法采用液体生产法生产口服液，可减少博落回生物碱提取纯化干燥工序，节约人力物力时间，降低生产成本。

博落回在兽药领域的应用关键难题之一是生物碱的提取分离。研究表明，4种提取生产工艺对生物碱提取得率影响较大，最高为11.6%，最低为8.15%，提取率从低到高依次为沸水提取法﹤酸水浸提法﹤乙醇浸提法﹤ 酸性乙醇浸提法。而酸性乙醇为博落回生物碱首选提取液，乙醇浓度增高，提取率逐渐增大，80～90%的乙醇提取率均在90%以上。

博落回口服液是以植物博落回为原料经提取生物碱后制成，主要含血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱等生物碱。研究表明，三批口服液样品在灭菌后生物碱含量平均下降0.15 mg/100 mL，占总量的2.8%；所以生物碱含量是比较稳定的，变化小。

pH值是口服液质量稳定的一项重要指标，研究表明，pH值变化对博落回口服液生产过程中生物碱含量稳定性影响较大，口服液的pH值在4-6时生物碱含量高较稳定。

在口服液的生产中，常常加入抗氧剂及金属络合剂等附加剂以防止和延缓药物的氧化分解，加入助溶剂以增加药液的澄明度。而这些附加剂的加入既要保护药物的有效成分不受氧化分解，又要不影响药物制剂的稳定性、澄明度和疗效。研究表明，硫代硫酸钠、亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠对生物碱的质量稳定性影响较大，可使生物碱质量降低0.67～0.37 mg/100 mL，在生产中应避免使用；而EDTA、吐温-80、Vc、亚硫酸氢钠等附加剂对生物碱质量稳定性影响较小，适合选用。加入抗氧剂后可使口服液的颜色浅淡而改善药液的澄明度。