HPLC法测定复方磺胺嘧啶钠注射液的含量

王庆红，孙真峥，廖 欢，谢丽丽，陈锡龙，赵 贵

(贵州省兽药饲料监察所,贵阳 550003)

磺胺类药物是一类应用普遍、效果良好的抗菌药物[1-3]，复方磺胺嘧啶钠注射液在养殖场中被大规模使用，不仅能够治疗畜禽的疾病[4-5]，而且还能增强畜禽的体质；在畜产品中兽药残留最大限量规定，磺胺最大残留量不超过100 μg/kg[6]。如使用不当、滥用或不遵守休药期, 将会产生兽药残留[7-9]；同时兽药质量没有好的检测方法进行监管，也会给养殖行业带来较大的危害[10]。

复方磺胺嘧啶钠注射液主要含有磺胺嘧啶和甲氧苄啶两个组分，在《中国兽药典》中测定磺胺嘧啶的含量使用的是“永停滴定法”，而测定甲氧苄啶使用的是“紫外-可见分光光度法”[11-12]，但检测繁琐，有机试剂较多，对人的身体伤害极大。

基于以上几点，建立一种既能快速定性定量检测，又对人身体伤害较小的方法很有必要。利用高效液相色谱仪对复方磺胺嘧啶钠注射液进行检测，一次性能够测定两个组分，并且定量准确，操作简便。目前高效液相色谱仪测定复方磺胺嘧啶钠注射液几乎没有研究，因此建立高效液相色谱法测定复方磺胺嘧啶钠注射液不仅对兽药监管很有必要，而且对畜禽产品质量起到重要保障[13]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备 Denver instrument TB-215 D型电子分析天平(美国丹佛公司)；Agilent 1260 infinity 高效液相色谱仪(配紫外检测器)；

1.1.2 对照品 ①磺胺嘧啶对照品来源于中国兽医药品监察所，批号：H0361504，含量99.5%；甲氧苄啶对照品来源于中国兽医药品监察所，批号：H0161210，含量100.0%。

②原料药：磺胺嘧啶钠：洛阳市正牧生物科技有限公司；批准文号：兽药原字162441631；批号：20180301；生产日期：20180308；含量：99.8%。甲氧苄啶：寿康富康制药有限公司；批准文号：国药准字H37020335；批号：A-10111710094；生产日期：20171031；含量：99.3%。

1.1.3 试验样品 收集了3批不同公司生产的复方磺胺嘧啶钠注射液制剂样品，样品信息见下表：

表1 试验样品信息Tab 1 Test sample information

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的配制 精密称取磺胺嘧啶对照品约50 mg及甲氧苄啶约10 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得磺胺嘧啶浓度约为1.00 mg/mL及甲氧苄啶浓度约为0.2 mg/mL的对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液5 mL置于50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得磺胺嘧啶浓度约为100 μg/mL及甲氧苄啶浓度约为20 μg/mL的对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的配制 精密量取复方磺胺嘧啶钠注射液5 mL(10 mL:1.0 g磺胺嘧啶钠+0.2 g甲氧苄啶)，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度。另取上述稀释液5 mL，置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。再另取第二次稀释液5 mL，置于50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.3 色谱方法 色谱柱:为Waters Symmetry C18(5 μm, 4.6 mm × 250 mm)色谱柱。柱温40℃；进样量：20 μL；测定波长240 nm；流动相A(0.1%磷酸溶液)与B(乙腈)85∶15等度洗脱。按外标法以峰面积计算含量，其中，磺胺嘧啶结果乘以1.0878，即为供试品中磺胺嘧啶钠(C10H9N4NaO2S)的含量。在此色谱条件下，磺胺嘧啶和甲氧苄啶两主峰附近均没有明显的干扰峰，并且对照品溶液和样品溶液主峰分离度好、保留时间一致，说明该方法专属性良好，色谱图见图1。

2 结果与分析

2.1 线性及范围 精密量取对照品贮备液20 mL置于100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，得含磺胺嘧啶200 μg/mL、含甲氧苄啶40 μg/mL的样品，依次吸取10 mL到20 mL分别得磺胺嘧啶12.5、

图1 复方磺胺嘧啶钠浓度为100 μg/mL对照品和样品图谱Fig 1 Chromatograms of reference substance of compound sulfadiazine sodium(100 μg/mL)

25、50、100、200 μg/mL及甲氧苄啶2.5、5、10、20、40 μg/mL的对照品溶液系列，精密吸取各对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以磺胺嘧啶或甲氧苄啶色谱峰面积(Area)，对其相应浓度(Amt，μg/mL)进行线性回归，求得回归方程，可知磺胺嘧啶钠在12.5～200 μg/mL及甲氧苄啶分别为2.5～40 μg/mL内线性关系良好。相关数据分别见表2和表3。

2.2 准确度和精密度 按照《中国兽药典》中药物回收率添加方法，在已知含量的复方磺胺嘧啶钠供试品中加入一定质量的磺胺嘧啶和甲氧苄啶原料，使其制备后在供试品中的量为其含量的80%，100%和120%，每个添加水平平行制备3份，其中磺胺嘧啶钠添加量为200、250、300 mg，甲氧苄啶添加量40、50、60 mg，按照2.2.3的方法测定峰面积，计算实际测得的量(实测值)，用实际测得的量比上样品的量与加入量的和，即得。回收率在98%～101%，准确度符合《中国兽药典》回收率范围要求；以变异系数来衡量精密度，RSD均小于2%，精密度符合《中国兽药典》关于精密度的要求。

表2 磺胺嘧啶钠溶液的标准曲线数据[14]Tab 2 Standard curve data of sulfadiazine sodium solution

表3 甲氧苄啶的标准曲线数据Tab 3 Standard curve data of trimethoprim

表5 磺胺嘧啶钠回收率测定结果Tab5 Recovery results of sulfadiazine sodium

表6 甲氧苄啶回收率测量结果Tab 6 Recovery results of trimethoprim

2.3 溶液稳定性试验 精密量取含磺胺嘧啶钠浓度约为100 μg/mL及甲氧苄啶约为20 μg/mL的样品溶液20 μL，分别约于0、24、48 h上机测定，每次进样2针，结果见表7。磺胺嘧啶钠和甲氧苄啶色谱峰面积的相对标准偏差分别为：0.7% 和1.9%，表明此法配置的溶液在48 h内稳定。

表7 溶液稳定性试验结果Tab 7 Stability measurement results

3 讨论与结论

3.1 流动相比例的选择[14-15]比较了3种比例的流动相，即0.1%磷酸-乙腈(80∶20)、(85∶15)和(90∶10)，其中0.1%磷酸-乙腈(80∶20)的流动相运行样品时，磺胺嘧啶色谱峰和甲氧苄啶色谱峰没有完全分离，0.1%磷酸-乙腈(90∶10)的流动相运行样品时，磺胺嘧啶色谱峰和甲氧苄啶色谱峰分离较好，但甲氧苄啶色谱峰出峰时间较长30 min。而0.1%磷酸-乙腈(85∶15)时，磺胺嘧啶色谱峰和甲氧苄啶色谱峰分离良好,磺胺嘧啶你和甲氧苄啶的出峰时间分别为6.7 min和8.5 min，故选择流动相0.1%磷酸-乙腈的比例为85∶15。

3.2 样品处理溶剂的选择[16-17]由于磺胺嘧啶，甲氧苄啶在水中都几乎不溶，在酸中易溶，即分别选择两种溶剂比较。溶解分别选用两种溶剂系统的比较。溶剂一：先加5 mL盐酸再加流动相定容；溶剂二：前两步稀释选用甲醇定容。结果分析：选用溶剂一在操作步骤上要注意细节，比如加盐酸到样品中摇匀后需要立即定容，步骤较繁琐，选用溶剂二在操作上更简便。前两步均用甲醇稀释的样品溶解更完全。

利用已建立好的“高效液相色谱法测定复方磺胺嘧啶钠注射液”对50批复方磺胺嘧啶钠注射液进行含量测定，方法不仅操作简便，定量准确，而且能够一次完成两个组分的测定，不需要分两次测定药物含量，添加回收率范围在98%～101%，符合《中国兽药典》的高效液相色谱法添加回收的要求，可以作为《中国兽药典》复方磺胺嘧啶钠注射液方法的有效补充，对该类兽药质量监管提供了一种更为有效的检测手段，为畜产品质量起到保驾护航的作用。