离子色谱法测定磺胺氯吡嗪钠中的钠离子

2020-07-15高立红龚旭昊马秋冉董玲玲赵富华于晓辉

中国兽药杂志 2020年6期

杨星，高立红，龚旭昊，马秋冉，董玲玲，赵富华，于晓辉*

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，北京 100102)

成盐是改善药物分子理化性质，提高其成药性的有效手段之一，可改变药物的溶解性，改善其依从性，提高其稳定性，减少其不良反应，而且在药物开发中，还可利用成盐来延长药物的专利保护期或规避其专利保护[1]。磺胺氯吡嗪是磺胺类抗球虫药，对球虫具有良好的活性，作用峰期为球虫的第二代裂殖体，对第一代裂殖体亦有一定的作用。其多在球虫病爆发时短期应用，尤其是对感染后大量处于裂殖生殖阶段的球虫，具有良好的杀灭作用，同时对大部分革兰氏阴性和阳性菌具有较强的抑制作用，能预防各种细菌的继发感染[2]。由于磺胺氯吡嗪的水溶性不佳，实际上市的药物是其钠盐磺胺氯吡嗪钠。

在化学对照品标定中，通常采用质量平衡法进行赋值，对于成盐对照品，需要准确测定成盐离子的含量。离子色谱法具有快速、方便、灵敏度高、选择性好，可同时分析多种离子，样品用量少等优点，目前已成为分析化学领域中发展最快的分析方法之一，被广泛地用于无机阴、阳离子和有机离子的测定[3-10]。因此，本研究建立了离子色谱法测定磺胺氯吡嗪钠中钠离子的含量，该方法准确，灵敏度高，专属性强，对于磺胺氯吡嗪钠对照品的标定赋值具有重要意义。

1 仪器与试药

Dionex Integrion离子色谱仪，配有CSRS 300(4 mm)抑制器，电导检测器及甲烷磺酸(MSA)在线淋洗液发生器(Thermo公司，Chromeleon 7色谱工作站)；Milli-Q去离子水发生系统(Millipore公司)；Mettler Toledo XS 205型电子分析天平(Mettler公司)。

磺胺氯吡嗪钠(扬州天和药业有限公司生产，批号：20180205)；钠单元素标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心，1000 μg/mL，批号：GSB04-1738-2004)；阳离子混合标准溶液(Thermo，含Li+50 mg/L、Na+200 mg/L、NH4+400 mg/L、K+200 mg/L、Mg2+200 mg/L、Ca2+1000 mg/L，批号：130204)；水为18.2MΩ·cm超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Dionex IonPac CS12A(250 mm×4 mm)，保护柱：Dionex IonPac CG12A(50 mm×4 mm)，流速：1.0 mL/min，柱温：30℃，进样量：25 μL，检测器：电导检测器，抑制器电流：117 mA，以淋洗液发生器产生的甲烷磺酸溶液为流动相，按表1进行梯度洗脱。

表1 梯度淋洗条件Tab 1 Procedure of gradient elution

2.2 溶液的制备

2.2.1 系统适用性试验溶液精密量取阳离子混合标准溶液(含Li+50 mg/L、Na+200 mg/L、NH4+400 mg/L、K+200 mg/L、Mg2+200 mg/L、Ca2+1000 mg/L)5 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

2.2.2 对照品储备液精密量取钠单元素标准溶液(含Na+1000 μg/mL)10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

2.2.3 对照品溶液精密量取钠单元素标准溶液(含Na+1000 μg/mL)1 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

2.2.4 供试品储备液取磺胺氯吡嗪钠约150 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.2.5 供试品溶液取磺胺氯吡嗪钠约15 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.2.6 线性试验溶液精密量取对照品储备液适量，加水稀释制成含钠离子分别为0.2、1、2、5、8、10、12、15 μg/mL的溶液。

2.2.7 回收率试验溶液精密量取9份供试品储备液5 mL，分别置100 mL量瓶中，再分别精密加入对照品储备液3、5、7 mL各3份，加水稀释至刻度，摇匀，制成含钠离子8、10、12 μg/mL的溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性分别精密量取2.2.1项下系统适用性试验溶液、2.2.3项下对照品溶液、2.2.5项下供试品溶液各25 μL，照2.1项下色谱条件测定。结果显示，在该色谱条件下，Na+与Li+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+均能基线完全分离，Na+测定不受干扰，方法专属性强，见图1～3图。

图1 系统适用性试验溶液色谱图Fig 1 Chromatogram of the system suitability solution

图2 对照品溶液色谱图Fig 2 Chromatogram of the standard solution

2.3.2 线性关系考察分别精密量取2.2.6项下线性试验溶液各25 μL，照2.1项下色谱条件测定。以平均峰面积为y轴，钠离子浓度为x轴，计算回归方程。结果表明：在0.2～15 μg/mL浓度范围内，钠离子溶液的峰面积与其浓度呈良好的线性关系，线性方程为y=0.3132x+0.0068，r2=1.0000。

2.3.3 精密度试验取浓度为10 μg/mL的对照品溶液，照2.1项下色谱条件，连续重复进样6次，钠离子峰面积的RSD为0.1%。

2.3.4 重复性试验平行配制6份磺胺氯吡嗪钠供试品溶液，照2.1项下色谱条件测定，计算钠离子的含量，平均含量为6.67%，RSD为0.4%。

2.3.5 回收率试验采用加样回收率试验测定准确度。分别精密量取2.2.7项下回收率试验溶液各25 μL，照2.1项下色谱条件测定，采用外标法计算回收率，结果见表2。

表2 钠离子回收率Tab 2 Recovery of Sodium ion

2.3.6 检测限与定量限取钠离子线性试验溶液适量，用水逐步稀释至一定浓度后测定，钠离子定量限为0.2 μg/mL(S/N>10)，检测限为0.1 μg/mL(S/N>3)。

2.3.7 耐用性试验采用不同柱温、不同流速进行测定。结果如表3所示，不同柱温、流速的耐用性均良好，仅保留时间发生改变。

表3 耐用性试验Tab 3 Robustness test

2.3.8 样品测定取供试品溶液，照2.1项下色谱条件测定，采用外标法以峰面积计算，钠离子含量为6.66%。

3 讨论

3.1 系统适用性试验溶液的考察为了考察环境、使用的试剂和容器中可能存在的微量Li+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+等阳离子对测定结果的影响[11-12]，系统适用性试验溶液选择Thermo公司生产的含6种阳离子的混合标准溶液(含Li+50 mg/L、Na+200 mg/L、NH4+400 mg/L、K+200 mg/L、Mg2+200 mg/L、Ca2+1000 mg/L)稀释制得。

3.2 色谱条件的考察参考离子色谱法测定钠离子相关检测方法[10-16]，色谱柱选择Dionex IonPac CS12A，流动相选择甲烷磺酸溶液(MSA)，不同文献MSA的浓度从2.2 mmol/L至20 mmol/L不等。本研究最初选择15 mmol/L的MSA作为淋洗液，在该条件下系统适用性试验溶液6种阳离子色谱峰之间的分离度均大于1.5，但在测定磺胺氯吡嗪钠时发现，虽然钠离子与铵根离子分离度大于1.5，但两峰的基线未完全分离。为消除铵根离子对钠离子测定的干扰，经考察，在淋洗液为5 mmol/L的MSA时，钠离子与铵根离子色谱峰的基线能完全分离，再通过梯度洗脱程序提高MSA浓度，增强洗脱能力，将其余阳离子迅速洗脱出来，缩短检测时间。

3.3 空白干扰与进样浓度的考察在钠离子含量测定时，钱敏等[10,13]选择外标法不扣除空白，闻宏亮等[12,14]选择标准曲线法不扣除空白，冯光等[11]选择标准曲线法扣除空白，张军霞等[15-16]选择外标法扣除空白进行计算，为了确定选择何种方式进行计算，本研究考察了空白对测定结果的影响。

使用PP进样瓶直接从超纯水机接18.2 MΩ·cm的去离子水作为空白时，空白中未检出Na+(图4)，但在进行检测限考察时发现，钠离子对照品溶液0.03、0.01、0.005 μg/mL的峰面积分别为0.0066、0.0059、0.0040，浓度与峰面积不呈线性，因此，推测在溶液配制过程中引入了微量钠离子。梳理整个溶液配制过程，需经过以下环节：盛装去离子水的塑料瓶、移液器枪头、玻璃量瓶、一次性无菌注射器、滤头、进样瓶。经试验，每个环节均可能引入Na+，除玻璃量瓶外，其他环节引入钠离子的峰面积总计低于0.004。

图4 水空白(18.2MΩ·cm)色谱图Fig 4 Chromatogram of the water(18.2MΩ·cm)

设计一组试验考察玻璃量瓶对空白的干扰。取10 mL量瓶，用去离子水稀释至刻度，摇匀，取其溶液作为清洗0次的空白溶液；将该量瓶中的水弃去，再用去离子水稀释至刻度，摇匀，取其溶液作为清洗1次的空白溶液；依次配制10 mL量瓶分别清洗0、1、3、5、7、9、11次的空白溶液，每份溶液进样2次，以清洗次数为横坐标，平均峰面积为纵坐标，作图(图5)。由图可知，当清洗0次时，钠离子峰面积高达0.025，清洗5次以上后，钠离子峰面积降至低于0.005，与其他环节总计引入的钠离子峰面积基本一致，可认为已消除玻璃量瓶引入的干扰。因此，为尽可能减少实验操作引入的空白干扰，在后续试验时，将玻璃量瓶用去离子水清洗9次。同时，为了验证9次的清洗次数是否充分，本研究测定了其他两种规格量瓶(50 mL、100 mL)分别清洗9次后的空白溶液，钠离子峰面积分别为0.002和0.003(见图6)。

图5 清洗次数对钠离子峰面积的影响Fig 5 Effects of the number of cleaning on peak area

图6 用去离子水清洗9次后的量瓶空白溶液色谱图Fig 6 Chromatogram of the blank of volumetric flask with nine times cleaning

综上所述，使用离子色谱法测定钠离子时，为降低环境、容器和操作引入的钠离子对测定造成的干扰，建议将量瓶用去离子水清洗9次，小心操作避免汗液等污染引入钠离子。

不同文献钠离子测定时选择的进样浓度从0.7、1.5至24 μg/mL不等[10-16]，经考察，空白溶液、2、10 μg/mL对照品溶液中钠离子的峰面积分别约为0.003、0.64、3.14，当进样浓度从2 μg/mL提高至10 μg/mL时，空白干扰对测定结果造成的偏差从0.5%降低至0.1%，同时考虑样品是否易溶于水等因素，本研究选择10 μg/mL作为进样浓度，此时空白造成的干扰较小，可不扣除空白直接采用外标法进行计算。

3.4 检测限与定量限的考察由于空白溶液中含有钠离子干扰，本研究未选择仪器计算所得信噪比作为方法的信噪比来确定检测限与定量限，而是将空白溶液中钠离子的峰面积(低于0.005)作为噪音，选择钠离子峰面积为0.026(大于3倍的空白溶液峰面积)的浓度0.1 μg/mL作为检测限，选择钠离子峰面积为0.052(大于10倍的空白溶液峰面积)的浓度0.2 μg/mL作为定量限。