益母黄丹口服液的制备工艺研究

孔 洁，孙弟芬，潘舒蕾，文 敏，叶脐濂，张 鹏，舒 刚

(四川农业大学，成都 611130)

益母黄丹口服液由益母草、黄精、丹参三味中药制成。益母草为君药，其中的益母草碱可以促进子宫和卵巢的发育，兴奋下丘脑垂体性腺轴，促进性腺激素的分泌，进而影响蛋鸡的生产性能，其主要化学成分有生物碱类、二萜类、黄酮等[1-3]。孙晓蛟等[4]研究发现，在基础日粮中添加益母草后产蛋率和蛋品质均显著提高。黄精为臣药，能调节气血，增强鹌鹑的抵抗力，增加了饲料的利用率。黄精多糖是黄精重要的活性成分，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效。刘家国等[5]研究表明，调整气血为主要药理作用的中药组方能够改善血液运氧能力，从而提高蛋鸡的生产性能。丹参作为佐药，辅佐益母草和丹参一起使鹌鹑的生殖机能保持较高的兴奋性，丹参主治月经不调、经闭经痛、胸腹刺痛、心烦不眠、肝脾肿大、心绞痛等[6]，药理作用十分广泛。

中药口服液是当前中药生产中新兴的，由中药汤剂为基础发展而来的热门剂型，具有起效快，作用明显，方便携带，便于保存等优点[7]。相较于西药以及抗生素，本试验选择中药制备提高老年鹌鹑产蛋性能的口服液的优势在于：安全、副作用少，对胃肠道、肝肾的刺激性小。西药注重药到病除、对症用药，并且大多采取注射等直接将药物送达患处，容易导致很多的副作用；而中药则更注重整体的恢复，本试验中的益母黄丹口服液采用口服的方式，通过改善老年鹌鹑子宫和卵巢的机能，兴奋下丘脑垂体性腺轴，促进性腺激素的分泌，进而影响蛋鸡的生产性能。本试验拟筛选出生产益母黄丹口服液的最佳制备工艺，为临床生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 口服液的制备及工艺优化 益母黄丹口服液以益母草、黄精、丹参三味药为3∶2∶1组成的配方，对组方进行料液比、煎煮时间、醇沉浓度、煎煮次数的单因素，正交实验的工艺优化，得出口服液的最优制备方法。

1.2 试验材料

1.2.1 试验试剂 益母草、黄精、丹参(均购于四川成都温江惠民大药房，经鉴定均符合《中国药典》2015 年版一部的要求)；丹参药材对照品(购自成都瑞芬思生物科技有限公司，DZYC-D-008)；黄精药材对照品(购自成都瑞芬思生物科技有限公司，DZYC-H-005)；丹酚酸B(购自成都瑞芬思生物科技有限公司，D-012-190312)；益母草碱(购自成都瑞芬思生物科技有限公司，Y-065-181216)。

1.2.2 试验仪器与设备 UV1100型紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)、XC-110A型超声波清洗器(济宁鑫欣超声电子设备有限公司)、PWC184电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、恒温水浴锅(余姚市亚星仪器仪表有限公司)、紫外分析仪(郑州豫华仪器制造有限公司)、硅胶G薄层板、BP211S型电子分析天平(北京Sartorius天平有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 口服液的制备工艺 将益母草15 g，黄精10 g，丹参5 g三味中药放入1000 mL烧杯中，加14倍蒸馏水浸泡0.5 h后，进行煎煮。取液静置，用8层纱布滤过，合并滤液并浓缩，将浓缩后的药液放凉后，加入乙醇进行醇沉。将通过醇沉后的药液搅拌均匀后静置于5 ℃冰箱24 h，随后置于离心机离心3000 r/ min×10 min，取出上层滤液，弃去残渣。加一定量蒸馏水置于滤液中，使药液中原生药含量达到1 g/mL。向药液中加入适量防腐剂，搅拌均匀，用0.2% NaOH调PH值使药液PH值在5-7之间。将所制药液进行分装，灭菌即可[8]。

1.3.2 标准曲线的建立 标准曲线：精密称取盐酸益母草碱0.6 mg，溶于25 mL流动相中，摇匀。制得0.024 mg/mL对照品溶液。分别取对照品溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、5.0 mL溶于5 mL动相中，分别摇匀，其浓度分别为0.0024 mg/mL、0.0048 mg/mL、0.0072 mg/mL、0.0096 mg/mL、0.024 mg/mL、0.0024 mg/mL的对照品溶液。在277 nm的波长处测定吸光度， 以吸光度 (A)为纵坐标，浓度 (C)为横坐标绘制标准曲线[9-11]。

1.3.3 单因素试验 以蒸馏水为提取溶剂，分别料液比、煎煮时间、煎煮次数、醇沉分数做单因素实验考察。进行单因素水平筛选时，控制其余三个因素不变，其中进行煎煮时间水平筛选时，乙醇浓度为60%，煎煮3次，料液比1∶14；进行醇沉体积分数水平筛选时[12]，煎煮时间为1.5 h，煎煮3次，料液比1∶14；进行煎煮次数水平筛选时，乙醇浓度为50%，煎煮时间为1.5 h，料液比1∶14；进行料液比水平筛选时，煎煮时间1.5 h，乙醇浓度为60%，煎煮3次。其余条件均按照制备工艺制成相应的口服液，并按照上述1.3.2含量测定方法测定各自盐酸益母草碱含量。

1.3.4 正交试验 更好地优化制备工艺，以益母草中益母草碱为指标，选取单因素试验三个因素进行正交试验考察，根据表1进行正交试验，并按照上述1.3.2含量测定方法测定各自盐酸益母草碱含量。

表1 影响含量的因素试验Tab 1 Factors Affecting Content Test

1.3.5 口服液定性检测 益母草碱的定性试验：吸取口服液10 mL，挥干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取盐酸水苏碱对照品，加无水乙醇制成1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5～10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以丙酮-无水乙醇-盐酸(10∶6∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，在105 ℃加热15 min，放冷，喷以稀碘化铋钾试液-三氯化铁试液(10 ∶1)混合溶液至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

吸取口服液3 mL，加70%乙醇20 mL，加热回流1 h，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄精对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)乙酸乙酯一甲酸(5∶2∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制 按1.3.2方法，以盐酸益母草碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸光度-益母草碱质量浓度标准曲线，得到方程：y = 3.3x + 2.4821，R2=0.9992，表明盐酸益母草碱质量浓度在0.002～0.025 mg/mL范围内与吸光度呈现良好的线性关系。

图1 盐酸益母草碱标准曲线Fig 1 Standard curve of Leonurus hydrochloride

2.2 优化工艺结果

2.2.1 单因素水平筛选 在考察煎煮时间单因素试验中，以煎煮次数3次，醇沉分数60%，料液比1∶14，煎煮时间水平为0.5、1.0、1.5、2.0 h，其余条件均按照制备工艺进行。制成的口服液按照1.3.2方法检测，结果如图2所示：

图2 煎煮时间水平含量曲线Fig 2 Horizontal content curve of decocting time

在考察煎煮次数单因素试验中，以煎煮时间1.5 h，醇沉分数60%，料液比1∶14，煎煮次数水平为1次、2次、3次、4次，其余条件均按照制备工艺进行。制成的口服液按照1.3.2方法检测，结果如图3所示：

在考察醇沉分数单因素试验中，以煎煮时间1.5 h，煎煮次数3次，料液比1∶14，醇沉分数水平为40%、50%、60%、70%，其余条件均按照制备工艺进行。制成的口服液按照1.3.2方法检测，结果如图4所示：

图4 乙醇分数水平含量曲线Fig 4 Ethanol fraction level content curve

在考察料液比单因素试验中，以煎煮时间1.5 h，煎煮次数3次，醇沉分数60%，料液比水平为1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，其余条件均按照制备工艺进行。制成的口服液按照1.3.2方法检测，结果如图5所示：

图5 料液比水平含量曲线Fig 5 Material liquid ratio horizontal content curve

经单因素试验筛选，得出最佳煎煮时间为1.5 h、最佳煎煮次数为2次、最佳醇沉分数为60%、最佳料液比为1∶14。为了更好地优化制备工艺，需对此四种因素进行正交试验考察，但由于料液比对试验结果的影响较小，于是选用煎煮时间、煎煮次数和醇沉分数三个因素进行正交试验考察。

2.2.2 正交实验优选 按照表1 中的正交试验设计进行试验，以盐酸益母草碱含量为指标，结果见表3。

从上表的数据分析可知：根据极差分析，对益母黄丹口服液中盐酸益母草碱含量影响的因素的顺序为：C>B>A，即煎煮次数、醇沉分数、煎煮时间。通过正交表确定最佳的制备方案为：煎煮1.5 h，煎煮3次，醇沉分数50%。

表2 正交试验盐酸益母草碱含量结果Tab 2 content results of Leonurus hydrochloride in orthogonal test

表3 益母黄丹口服液正交试验表Tab 3 Orthogonal test of Yimu Huangdan oral liquid

2.2.3 验证试验 为了确定正交试验确定的条件是否为最佳工艺，按照2.2.2确定的最佳制备方案A2B3C1进行3组重复试验，结果如表5所示，盐酸益母草碱的含量分别为1.28、1.31、1.21 mg，平均值为1.26 mg，RSD为4.05%，表明该提取条件稳定可行，具有重现性和稳定性，确定最佳的制备方案为：煎煮1.5h，煎煮3次，醇沉分数50%。

表4 正交工艺验证Tab 4 Orthogonal process validation

2.3 定性测定结果

2.3.1 益母草定性检测结果 如图6所示，供试品与对照药材在相同位置上显相同颜色的斑点。益母黄丹口服液中含有益母草成分。

1：供试品；2：对照品1: Test article; 2: control article图6 益母草定性鉴别图Fig 6 Qualitative identification of Leonurus japonicus

2.3.2 黄精定性测定结果 如图所示，供试品与对照药材在相同位置上显相同颜色的斑点。益母黄丹口服液中含有黄精成分。

1：供试品；2：对照药材1: Test article; 2: reference medicine图7 黄精定性鉴别图Fig 7 Qualitative identification of Polygonatum

3 讨论与结论

3.1 试验考察因素的确定 益母黄丹口服液制备工艺受多种因素影响，在进行口服液制备工艺试验前，参考张学谦等[13]益母草的提取工艺研究以及刘清华等[14]多花黄精中总黄酮提取工艺优化及可视化分析中，确定了本试验的考察因素即：煎煮时间、煎煮次数、醇沉分数、料液比。通过单因素水平筛选试验，得出煎煮次数、煎煮时间、醇沉浓度、料液比变量曲线。但以图4所示可知，料液比对口服液制备工艺影响甚微，其中以1∶14适宜。分析其原因，可能是料液比梯度变化较小，对药物有效成分溶出影响不大。因此，在下一步进行正交试验时，则只选取煎煮时间、煎煮次数、醇沉浓度作为考察因素。

3.2 煎煮次数对口服液的影响 在煎煮过程中，随着煎煮次数的增多，更多的有效成分从药材中提取出来，但同时也会引起非有效成分的溶出和浓缩时间的加长。在确立最佳煎煮次数的单因素试验中，煎煮2次相较于煎煮1次，盐酸益母草碱中含量提升了近1倍。而后，随着煎煮次数的增多，盐酸益母草碱的含量稍有降低。在钱爱军[15]的研究中表明，一般情况下煎煮次数为2次，煎煮次数过多不仅提取的有效成分不高而且也增加工艺成本。此外，煎煮次数过多会导致浓缩时间增长，引起有效成分挥发。

3.3 煎煮时间对口服液的影响 在确立最佳煎煮时间单因素试验中，由图1显示可知，0.5～1.5 h时间段中随着煎煮时间的增多，盐酸益母草碱含量不断增加，但在煎煮2 h后，含量明显减少。煎煮过程是中药材中有效成分不断溶出的过程，但当药材本身与药液中有效浓度平衡时，这种扩散运动就会形成动态平衡[16]。过短的煎煮时间可能导致有效成分溶出不充分，但可通过多次煎煮补充。过长的煎煮时间可能导致有效成分的挥发和非有效成分的溶出。非有效成分的溶出，可能引起在醇沉或离心时夹杂着有效成分的沉淀。

3.4 醇沉对口服液的影响 醇沉法是最常见的药物提取方法，但也会导致大量有效成分损失的情况。在杨建春等[17]的研究中表明，益母草口服液在低温下醇沉会使成品质量有较大幅度的提高，放置过程不会析出沉淀。除了醇沉方法以外，刘健等[18]指出，出现了如：超临界流体提取法、酶解提取法、超声波提取法等提取新工艺。新工艺提高了药物的提取率，也保证了中药口服液的稳定性和药物效果，但是有工艺复杂、成本高等问题，在兽药中的应用范围亟待扩大。

益母黄丹口服液虽以盐酸益母草碱为主要成分，但也包含许多多糖成分，容易因醇沉分数不合适导致将药物中的多糖随杂质流失。陈健岳等[19]在研究中表明，在醇沉过程中，一般浓缩药液含醇量在50%～ 60%可以除去淀粉，其它多糖一般在此浓度也开始沉淀。其研究结果与本试验一致。在确定醇沉分数单因素试验中，结果表明50%～60%含量最多，超过60%后有效成分含量明显减少。试验最终确定的50%醇沉分数既可以保障口服液中的大多数黄精多糖的含量，也提高了口服液的稳定性和澄清度。

3.5 最佳制备工艺的确立 经单因素试验数据显示，最佳煎煮时间为1.5 h、最佳煎煮次数为2次、最佳醇沉分数为60%，此结果与正交试验结果不同。于是，根据两种方案，再进行一次对比试验，试验结果表明，但单因素试验结果条件所制备的口服液中盐酸益母草含量平均为1.24 mg较正交试验结果条件制成的口服液中的1.31 mg少。因此，确立最佳制备方案为煎煮时间1.5 h、煎煮次数3次，醇沉分数50%。

3.6 结论 益母黄丹口服液由益母草、黄精、丹参3∶2∶1研制而成，其最优制备工艺为煎煮时间1.5 h，煎煮3次，醇沉分数50%。制备成的口服液呈深褐色，味苦，澄清透明，色泽均匀，无明显杂质沉淀，紫外分光光度法能测定口服液中益母草碱含量。薄层色谱中益母草、黄精斑点清晰，阴性对照无干扰。