高效液相色谱法测定九叶酒中标志性成分淫羊藿苷含量

李婷婷，陈茂钦，张 竞，王 倩，王雪芹

（河南省食品药品检验所，河南 郑州 450018）

九叶酒是以黄芪、淫羊藿、山茱萸、石斛、生地黄、枸杞、桂圆、大枣、白酒、水为主要原料加工制成的保健酒，具有缓解疲劳、增强免疫力的功能，方中淫羊藿为主要原料。因此，本研究中参考文献[1 －10]建立了测定九叶酒中淫羊藿苷含量的高效液相色谱(HPLC)法，为该制剂的生产过程及质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：Waters2695－2998 型液相色谱仪（沃特世公司）；XPE205 型电子天平（梅特勒公司，精度为十万分之一）。

试药：淫羊藿苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110737 －201516，含量为94.2% ）；九叶酒（河南省艾民股份有限公司，批号分别为20181123 －01，20181123－02，20181123－03，20181124－1，20181124－3，20181124－5，20190212－1，20190212－2，20190212－3）；甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）；超纯水；甲醇、磷酸二氢钠、醋酸、磷酸均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释成每1 mL 含50 μg 的溶液，即得对照品溶液。精密量取样品（批号为20181123 －03）2 mL，置25 mL 容量瓶中，并用50%甲醇定容，摇匀，经0.45 μm 滤膜滤过，即得供试品溶液。精密量取不含淫羊藿药材的阴性样品2 mL，置25 mL 容量瓶中，并用50%甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm 滤膜滤过，即得阴性对照品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：XSelect®CSH C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－水（30 ∶70，V／ V）；流速：1.0 mL／min；柱温：35 ℃；检测波长：270 nm；进样量：10 μL。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.1 项下3 种溶液注入色谱仪，记录色谱图，详见图1。淫羊藿苷峰与相邻杂质峰均能基线分离，表明该方法的专属性良好。

线性关系考察：取淫羊藿苷对照品10.97 mg，精密称定，置20 mL 容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；分别精密量取0.5，1.0，1.0，3.0，2.0 mL，分别置10，10，5，10，5 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，制成质量浓度为0.025，0.050，0.100，0.150，0.200 mg ／mL 的线性试验溶液；再取质量浓度为0.05，0.10 mg／mL 的线性试验用溶液各1 mL，分别置10 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，制成质量浓度为0.005，0.010 mg／mL的线性试验用溶液，摇匀，取10 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X，μg／mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y ＝22 016 X－19 645， r ＝0.999 5。结果表明，淫羊藿苷质量浓度在5.166 9 ～206.674 8 μg ／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

图1 高效液相色谱图

精密度试验：取同一对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续测定6 次，记录峰面积。结果淫羊藿苷峰面积的RSD 为1.01%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20181123 －03）样品依法制备供试品溶液，取2 mL 置25 mL 容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，配制6 份，分别进样计算含量。结 果 平 均 含 量 为0.637 mg／mL， RSD 为0.44%（n ＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取上述对照品溶液及供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，18，24 h 时进样测定。结果淫羊藿苷含量的RSD 分别为1.22%和0.34%，表明待测溶液在24 h 内稳定。

定量限与检测限确定：取线性关系考察项下的质量浓度最低的对照品溶液逐级稀释后测定，按信噪比10 ∶1 为定量限，3 ∶1 为检测限。结果表明，本方法定量限为103.34 ng／mL，检测限为20.67 ng／mL。

加样回收试验：称取淫羊藿苷对照品10 mg，精密称定，置20 mL 容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品浓溶液，精密量取1 mL，置10 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。精密量取已知含量的样品（批号20181123 －03，含量为每100 mL 含63.9 mg）1 mL，平行取9 份，置25 mL 容量瓶中，分别加入质量浓度为0.479 48 mg／mL 的对照品溶液0.7，1.3，2.0 mL（每个浓度3 份），用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。取10 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取9 批样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，计算含量。批号为20181123－01，20181123－02，20181123－03，20181124－1，20181124－3，20181124－5，20190212 －1，20190212 －2，20190212 －3 的 样 品 中 淫羊藿苷含量分别为每100 mL 含58.8，59.2，63.7，55.1，55.7，69.1，73.2，73.5，73.3 mg。

表1 淫羊藿苷加样回收试验结果（n ＝9）

3 讨论

3.1 测定波长选择

提取淫羊藿苷的HPLC －PDA 图，显示淫羊藿苷在269 nm 波长处有最大吸收，故选270 nm 为测定波长。

3.2 流动相选择

参考文献[1 －10]，曾分别对乙腈－水[1－6]、乙腈－0.05%磷酸溶液[7－8]（pH 为2.5）、甲醇－水[9]、乙腈－0.4%醋酸水溶液[10]（pH 为3.2）、乙腈－10 mmol／L 磷酸二氢钠溶液（pH 为5.0）系统进行了考察，发现当有机相用甲醇时，比例提高至水－甲醇（50 ∶50，V／ V）时，淫羊藿苷峰保留时间为21.8 min，且供试品溶液主峰与前面杂质峰未达到有效分离，显示甲醇对目标测定成分淫羊藿苷的洗脱能力比乙腈弱，故选有机相为乙腈。无论水相中加醋酸、磷酸或磷酸二氢钠溶液，都与选用等比例纯水时，淫羊藿苷主峰保留时间、峰形及分离度无差异，故选用水相为纯水。淫羊藿苷水相比例微调，对保留时间影响较大，但调整比例在2%内时，色谱峰形尖锐，其分离度均大于1.5。结合2015 年版《中国药典(一部)》中淫羊藿中淫羊藿苷的含量测定方法，选定流动相比例为乙腈－水（30 ∶70，V／ V）。

3.3 耐用性考察

曾用色谱柱Zorbax SB －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）和HypersilTMGOLD 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），分离效果好，换用仪器Waters 2695 －2998 液相色谱仪、安捷伦1260 液相色谱仪、戴安U3000 液相色谱仪测得结果均相近，表明该方法耐用性较好，重复性强。

3.4 药材转移率

取制备九叶酒的淫羊藿药材，测定药材中淫羊藿苷含量，根据处方，计算得药材转移率为81.33%。