颈舒颗粒中有效成分含量测定

叶 慧，李 敏

（江苏省泰州市食品药品检验所，江苏 泰州 225300）

颈舒颗粒是一种常用于治疗颈椎病的6 类中成药，由三七、川芎、当归、肉桂、红花、天麻、人工牛黄7 味中药材组方。方中三七为君药，化瘀、止痛、活血[1]；当归[2]、红花[3]、川芎[4]共为臣药，补血行气，活血祛瘀，以增强三七的活血化瘀止痛效力；肉桂[5]、天麻[6]为佐药，肉桂温阳通脉，天麻入肝经，善治风寒湿痹、眩晕麻木、肢体拘挛；人工牛黄为使药，由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工制成[7]5，70，173，开窍通络，药性寒凉[8]，加入药性辛温的肉桂，既可平衡其寒凉，又能助其开窍通络之功效，引领各药直达病所。其功能活血化瘀、温经、通窍、止痛，临床主要用于神经根型颈椎病瘀血阻络证，症见颈肩部僵硬、疼痛，患侧上肢窜痛等[7]1568－1569，对于气滞血瘀证型颈椎病有较好效果[9－10]，配合针灸、手法、理疗等能提高疗效[11－12]。其现行质量标准收录于2015 年版《中国药典（一部）》，含量测定项下对三七药材的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1进行了定量测定，以及人工牛黄中的胆酸进行定量测定。在原标准基础上，本研究中进一步补充了含量测定项的不足，建立了颈舒颗粒中有效成分含量测定的高效液相色谱（HPLC）法，为后续质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Acquity Arc 型高效液相色谱仪（包括Empower®3 工作站，四元梯度泵，2998 PDA 检测器，自动进样器和柱温箱），Waters®e2695 Separations Module 型高效液相色谱仪（包括Empower®3 工作站，四元梯度泵，2424 ELS 检测器，自动进样器和柱温箱），均购自美国Waters 公司；8200 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，功率为500 W，频率为53 kHz）；Milli－Q型超纯水处理系统（美国Millipore 公司）；XS105DU 型电子天平（瑞士Mettler 公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

三七皂苷R1对照品（批号为110745 －201318，纯度为94.0%），人参皂苷Rg1对照品（批号为110703 －201530，纯度为91.7%），人参皂苷Re 对照品（批号为110754 －201626，纯度为97.4% ），人参皂苷Rb1对照品（批号为110704 －201424，纯度为93.7%），人参皂苷Rd 对照品（批号为111818，纯度为92.1%），胆酸对照品（批号为100078 －201415，纯度为98.9%），猪去氧胆酸对照品（批号为100087 －200610，纯度为99.0%），均购自中国食品药品检定研究院；颈舒颗粒（国药集团精方＜安徽＞药业股份有限公司，批号分别为171202，171209，180631）；三七、当归、川芎、红花、天麻、肉桂、人工牛黄药材（市售，经泰州市食品药品检验所仇雅静主任中药师鉴定为正品）；乙腈为色谱纯（Fisher 公司）；甲醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 三七药材中5 种成分含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Waters XBridge C18柱（250 mm ×4.6 mm，3.5 μm）；流动相：A 为乙腈溶液，B 为水溶液，梯度洗脱，0 ～20 min 时20%A，20 ～45 min 时20%A ～46%A，45 ～55 min 时46%A ～55%A，55 ～60 min 时55%A，60 ～62 min 时55%A ～20%A，62 ～70 min 时20%A；流速：0.8 mL／min；柱温：30 ℃；检测波长：203 nm；进样量：10 μL。人参皂苷Rg1峰与人参皂苷Re 峰的分离度均大于1.5。

2.1.2 溶液制备

精密称取三七皂苷R1对照品，人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd 对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含三七皂苷R10.40 mg、人参皂苷Rg10.52 mg、人参皂苷Re 0.16 mg、人参皂苷Rb10.79 mg、人参皂苷Rd 0.72 mg 的混合对照品溶液。取样品，研细，混匀，取2.0 g，精密称定，置锥形瓶中，加入30 mL 乙醚，振摇提取2 h[2]，过滤，滤渣挥干，精密量取40 mL 甲醇，称定质量，超声处理（功率为250 W，33 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，蒸干，残渣加20 mL 水溶解，用水饱和正丁醇溶液萃取3 次，每次25 mL，合并正丁醇液，用水饱和正丁醇溶液洗涤2 次，每次25 mL，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。取缺三七药材的其他药材，按颈舒颗粒标准制法煎煮、浓缩为阴性样品，按供试品溶液制备方法制备缺三七药材的阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察[4]

专属性试验：按拟订色谱条件分别对2.1.2 项下3种溶液进样分析，记录色谱图，对照品溶液出峰顺序为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd。结果供试品溶液与对照品溶液色谱相应峰保留时间一致，阴性对照无干扰，且各组分相邻成分之间分离度均较好（R ＞1.5）。色谱图见图1。

线性关系考察：取适量对照品，精密称定，配成每1 mL含三七皂苷R10.74 mg、人参皂苷Rg12.62 mg、人参皂苷Re0.37mg、人参皂苷Rb12.75mg、人参皂苷Rd0.76mg的混合对照品溶液，稀释2，3.33，5，10，20 倍[6]，分别进样10μL，记录峰面积，以对照品溶液质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程。结果见表1。

精密度试验：取2.1.1 项下对照品混合溶液，连续进样6 次。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 色谱峰面积的RSD 分别为0.30%，0.47%，0.51%，0.40%，0.44%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为171202）适量，精密称定，平行制备供试品溶液6 份，依法测定含量。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 的平均含量分别为1.46，2.95，0.38，1.92，1.45 mg ／g， RSD 分 别 为1.78% ，1.44% ，2.01% ，1.57%，1.67%（n ＝6），表明方法重复性良好。

图1 三七高效液相色谱图

表1 三七中5 种成分的线性关系考察结果

稳定性试验：取样品（批号为171202）适量，精密称定，依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，18，24 h时进样测定，记录峰面积。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 峰面积的 RSD 分 别 为1.40% ，0.13% ，0.95% ，1.21% ，0.56%（n ＝7），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为171202），研细，称取6 份，每份1.0 g，精密称定，加入混合对照品溶液（质量浓度分别为三七皂苷R10.40 mg ／mL、人参皂苷Rg10.52 mg／mL、人参皂苷Re 0.16 mg ／mL、人参皂 苷Rb10.79 mg ／ mL、人 参 皂 苷Rd 0.71 mg ／ mL）2 mL，依法制备供试品溶液，定容至10 mL 容量瓶中，摇匀，即得。按拟订色谱条件进样10 μL，测定峰面积，计算平均加样回收率。结果见表2。

2.1.4 样品含量测定[10]

取3 批样品，对比2015 年版《中国药典(一部)》与本研究中改进的提取方法制备供试品溶液，按外标法分别计算3 批样品中5 种成分的含量。结果见表3。

2.2 人工牛黄中胆酸、猪去氧胆酸含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC －C18柱（150 mm ×4.6 mm，2.7 μm）；流动相：A 为乙腈溶液，B 为0.2%甲酸溶液，梯度洗脱，0 ～7 min 时5%A，7 ～20 min 时5%A ～80%A，20 ～25min 时80%A ～90%A，25 ～30min 时90%A ～96%A；流速：0.8 mL／min；柱温：25 ℃；检测器增益：10；气体压力：40 psi；喷雾器模式：加热；功率级别：65%；漂移管温度：60 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

取胆酸、猪去氧胆酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含胆酸0.89 mg、猪去氧胆酸0.68 mg 的混合对照品溶液。取样品适量，研细，取0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超声处理（功率为250 W，频率为50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺人工牛黄药材的其他药材，按颈舒颗粒标准制法煎煮、浓缩为阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备缺人工牛黄的阴性对照品溶液。

表2 加样回收试验结果（n ＝6）

表3 3 批样品中皂苷类成分含量测定结果（mg ／g）

图2 人工牛黄高效液相色谱图

2.2.3 方法学考察

专属性试验：按拟订色谱条件分别对2.2.2 项下3种溶液进样分析，记录色谱图，对照品溶液出峰顺序为胆酸、猪去氧胆酸。结果供试品溶液与对照品溶液色谱相应峰保留时间一致，阴性对照无干扰，且各组分相邻成分之间分离度均大于1.5。色谱图见图2。

线性关系考察：取2.2.2 项下对照品溶液进行不同比例的稀释，得系列线性对照品溶液，精密吸取各级对照品溶液各10 μL，按拟订色谱条件注入液相色谱仪，测得峰面积，以进样量对数值（X）为横坐标、峰面积对数值（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y胆酸＝8.744 510 4 X胆酸－6.353 103，r ＝0.999 9；Y猪去氧胆酸＝7.101 810 4 X猪去氧胆酸＋6.619 103，r ＝0.999 4。胆酸和猪去氧胆酸进样量对数值分别在1.94 ～19.45 μg 和1.00 ～9.97 μg 范围内与峰面积对数值线性关系良好。

精密度试验：取上述胆酸、猪去氧胆酸混合对照品溶液，连续进样6 次，记录色谱峰面积。结果的RSD 分别为1.90%和1.35%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为171202）适量，精密称定，依法平行制备供试品溶液6 份，按拟订色谱条件测定。结果胆酸和猪去氧胆酸平均含量分别为11.63 mg／g，7.67 mg／g，RSD 分别为0.29%和1.27%（n ＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为171202）适量，精密称定，依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12 h时进样，记录峰面积。结果胆酸、猪去氧胆酸的RSD 分别为1.89%和1.92% （n ＝7），表明供试品溶液在12 h内稳定。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为171202），研细，称取6 份，每份0.25 g，精密称定，加入（胆酸质量浓度为0.89 mg／mL、猪去氧胆酸质量浓度为0.68 mg／mL）混合对照品溶液2 mL，依法制备供试品溶液，定容至10 mL 容量瓶中，摇匀，按拟订色谱条件进样10 μL，测定峰面积，计算回收率。结果见表4。

表4 加样回收试验结果（n ＝6）

2.2.4 样品含量测定

取3 批样品，依法制备供试品溶液，采用HPLC －蒸发光散射检测器(ELSD)法和HPLC－紫外可见分光光度(UV)法分别按改进方法和2015 年版《中国药典(一部)》方法测定样品中有效成分的含量。结果见表5。

表5 3 批样品胆酸、猪去氧胆酸含量（mg ／g）

3 讨论

3.1 三七药材前处理考察

曾考察甲醇超声、乙醚脱脂甲醇超声、乙醚脱脂甲醇超声再浓缩、乙醚脱脂甲醇超声后正丁醇萃取4 种前处理方法。结果表明，经过乙醚洗涤、甲醇提取、正丁醇萃取、蒸干定容等步骤，溶剂峰减小，皂苷成分出峰明显，分离度高，峰型较好，且杂质峰较少。

2015 年版《中国药典(一部)》中三七含量测定项前处理（采用乙醚放置12 h，甲醇超声提取），既浪费时间，又不能充分提取三七中皂苷类活性成分；改进后采用乙醚振摇提取，甲醇超声提取、正丁醇萃取，既节约时间，又能提高活性成分的提取率。

3.2 人工牛黄药材前处理考察

参考2015 年版《中国药典（一部）》中颈舒颗粒含量测定项－人工牛黄，采用HPLC －UV 法，乙腈－0.2%磷酸水溶液（35 ∶65，V／ V），等度洗脱，色谱峰出峰快，且相应低；考虑到胆酸、猪去氧胆酸紫外吸收均为末端吸收，于紫外波长192 nm 检测时，灵敏度低。采用HPLC－ELSD 法，以乙腈－0.2%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，基线稳定，检测的灵敏度更高。