黄芪改善衰老小鼠生殖功能的抗氧化机制研究

朱嵩岳，伯 乐，杨光照，尹 娜，吴晨婷，茅彩萍

（苏州大学附属第一医院生殖医学中心，江苏 苏州 215006）

人类女性生殖系统比绝大部分机体系统衰老得更迅速，生殖能力与年龄呈负相关[1]。随着年龄的增长，卵母细胞、卵丘细胞和卵泡液中活性氧增加和抗氧化水平降低引起女性生殖系统氧化应激压力增高，生育能力降低[2]。目前，临床主要治疗手段有免疫治疗、内分泌治疗等，有关中医药的治疗较少。黄芪（AS）在临床常用于防治免疫功能紊乱性疾病、心脑血管疾病、肿瘤等多种疾病，疗效确切[3]。黄芪可发挥抗衰老作用，可能是通过抗氧化、调节免疫功能、改善衰老基因和相关酶表达、抑制端粒酶缩短等作用机制而实现[4－5]，但其对女性氧化应激和卵巢生殖功能方面的作用未见报道。现代药理学研究表明，黄芪的安全有效剂量范围为9 ～30 g[6]。故本研究中选取黄芪平均治疗量为20 g，按体表面积换算，小鼠用量为400 mg／kg。D－半乳糖在半乳糖氧化酶作用下分解成过氧化氢和醛糖，导致机体活性氧和超氧自由基累积，氧化应激增加，造成组织和细胞损伤，是用于构建衰老小鼠的常用药物[7]。本研究中探讨了黄芪对卵巢衰老生殖功能的影响及机制，为临床治疗卵巢衰老提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：ETC811 型基因扩增仪（苏州东胜兴业科学仪器有限公司）；Gene Amp9700 型Q－PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司）；TEC －VEMJ2 型全自动组织包埋机（日本樱花公司）。

试药： D－半乳糖（D－Galaactose，T0591，批号为20160406，美国Targrt Mol 公司）；黄芪Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge 干燥根提取物（b21616 －1g，批号为20160605，上海源叶生物科技有限公司）；孕马血清促性腺激素（PMSG，P9970，批号为20161012，北京索莱宝科技有限公司）；人绒毛膜促性腺激素（HCG，BM0066，批号为20160815，武汉博士德生物工程有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）检测试剂盒( 苏州绿叶日用品有限公司)；RNeasy Mini Kit（74101，批号为A180502A，美国Qiagen 公司）；逆转录－聚合酶 链式反应(RT－PCR)试剂盒（RR047A，批号为157019548， 日 本 Takara 公 司）； 引 物（ 批 号 为HG1811290022，南京锐真生物公司）。

动物：60 只SPF 级ICR 雌性小鼠和10 只SPF 级ICR 雄性小鼠，8 周龄，体质量（22.1 ±2.9）g，购自昭衍（苏州）新药研究中心有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（苏）2018 －0006。自由饮食饮水，期间喂食标准颗粒饲料，饲养环境温度为18 ～25 ℃，相对湿度为40% ～60%，光照周期12 h ∶12 h。所有动物实验方案均按苏州大学第一附属医院伦理委员会规定进行。

1.2 方法

动物模型建立：选取60 只8 周龄ICR 雌鼠，体质量均在（22 ±3）g，随机分为空白对照（CON）组、衰老模型（ D － gal）组、黄芪治疗组（ D － gal ＋AS）组，每组20 只。在相同环境下饲养，饲料和水均经过灭菌处理。D －gal 组皮下注射D－gal[（200 mg／（kg·d）]42 d，超纯水灌胃（每10 g 体质量0.2 mL）30 d，小鼠出现精神萎靡、毛色枯黄、行动迟缓等现象为造模成功；空白对照组注射与D －gal 组等体积的生理盐水42 d，超纯水灌胃（每10 g 体质量0.2 mL）30 d；D －gal ＋AS 组皮下注射D－gal[200 mg（kg·d）]42 d，黄芪[400 mg／（kg·d）]灌胃（每10 g 体质量0.2 mL）30 d。

体外受精实验：造模后，各组均取6 只小鼠腹腔注射PMSG 0.1 mL（5 U），48 h 后，注射HCG 0.1 mL（5 U）。在注射PMSG 后第4 天清晨9：00，处死小鼠，取出卵丘－卵泡复合物；同时，处死雄鼠，取附睾尾内精子在体外与卵丘－卵泡复合物结合6 h 后置二氧化碳(CO2)培养箱（CO2体积分数为5%，温度为37 ℃）培养，并将受精卵体外培养至囊胚阶段，观察受精卵及各阶段胚胎情况，计数并比较各组的二细胞数、四细胞数及囊胚数。

血清和卵巢SOD 和MDA 检测：其余小鼠颈部脱臼法处死后收集血样，离心，取上清液；同时，取卵巢组织，迅速用生理盐水洗净，在冰上用小组织剪剪碎，放入匀浆管，用匀浆机匀浆，取上清液；上清液行SOD 活性、MDA 含量测定。操作方法均严格按试剂盒说明书进行。

囊胚相关氧化应激基因mRNA 表达检测：用研钵在液氮环境下将体外培养的囊胚组织研磨成粉末，放入1.5 mL 无RNA 酶离心管内，用RNeasy Mini Kit 试剂盒提取RNA，用RT －PCR 试剂盒逆转录为cDNA，用于目的基因扩增，用Q －PCR 仪连续荧光检测扩增，程序设定为UDG 酶激活50 ℃，时间2 min，预变性温度95 ℃，时间2 min；变性温度95 ℃，3 s，退火、延伸，温度60 ℃，30 s，持续40 个循环，于60 ℃处收集荧光，每个样本均以β－actin 作为对照，行三复孔检测。采用Graph Pad Prism7 软件进行分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计学软件分析，行LSD － t 检验和单因素方差（ANOVA）分析。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

连续造模42 d 后，各组小鼠均未出现呕吐、拒食等病理情况。

2.2 促排卵后体外受精结果

3 组小鼠平均排卵数无统计学差异（P ＞0.05）；与CON 组相比，D －gal 组小鼠平均二细胞数、四细胞数及囊胚数均显著减少（P ＜0.05）；D－gal ＋AS 组中二细胞数、四细胞数及囊胚数较D－gal 组显著增加（P ＜0.05）。详见表1。

表1 3 组小鼠排卵数及早期胚胎各阶段正常胚胎数（± s，n ＝6）

表1 3 组小鼠排卵数及早期胚胎各阶段正常胚胎数（± s，n ＝6）

注：与D －gal 组相比， P ＜0.05。图1 和图2 同。

组别CON 组D－gal 组D－gal ＋AS 组排卵数29.55±2.84 25.16±3.51 32.12±4.05二细胞数20.91±4.48 16.27±4.27 26.50±5.43四细胞数20.61±4.18 14.27±3.69 23.38±5.74囊胚数16.05±6.34 9.66±1.66 17.77±3.99

2.3 小鼠血清、卵巢、囊胚中SOD 和MDA 水平

D －gal 组小鼠血清中SOD 水平较CON 组显著降低（P ＜0.05），D－gal ＋AS 组较D－gal 组SOD 水平显著升高；D－gal 组中MDA 水平较正常组显著升高（P ＜0.05），D － gal ＋AS 组MDA 水 平 较 D － gal 组 显 著 降 低（P ＜0.05）。 D－gal 组小鼠卵巢组织中SOD 水平较CON 组显著降低（P ＜0.05），D －gal ＋AS 组较D－gal组SOD 水平显著升高（P ＜0.01）；D－gal 组中MDA 水平较CON 组显著升高（P ＜0.05），D －gal ＋AS 组MDA水平较 D－gal 组显著降低（P ＜0.05）。 D －gal 组与CON 组相比，囊胚SOD1和SOD2基因表达水平显著降低（P ＜0.05）；与D －gal 组相比，D－gal ＋AS 组中囊胚SOD1和SOD2表达水平显著升高（P ＜0.05）。详见图1 和图2。

图1 3 组小鼠血清、卵巢、囊胚中SOD 和MDA 水平（n ＝14）

图2 囊胚中SOD1 和SOD2 表达水平（n ＝14）

3 讨论

高龄所伴随着的卵巢衰老是影响生殖健康的重要原因[1]。卵巢衰老直接影响卵子质量，而卵子老化导致卵母细胞线粒体结构异常、纺锤体及染色体排列异常、活性氧（ROS）增加等问题，进一步导致卵母细胞质量下降，可能出现低生育率、胚胎发育异常和先天性缺陷等生殖相关疾病，其中最主要的原因是ROS 增加[8－9]。机体一般处于ROS 平衡状态，即抗氧化水平与氧化水平持平，但当抗氧化水平降低或氧化水平增高时，则会产生过多的ROS，会对机体中的DNA、脂质等大分子造成损害[10]。脂质氧化最终产物为MDA，是机体氧化程度判定的重要指标之一，过量的MDA 会破坏细胞膜中的不饱和脂肪酸，D －半乳糖可能产生过量的超氧阴离子和过氧化氢，导致脂质过氧化物在细胞膜中过量沉积，从而增加了MDA 的含量[11]。SOD 是机体最重要的抗氧化酶之一，是抵挡ROS 的第一道防线，催化超氧化物向过氧化氢转化，对于正常细胞功能有重要意义[12]。当MDA代谢过量和SOD 水平下降时，则表示机体氧化应激水平增强，ROS 增加，引发衰老[13]。

黄芪多糖、黄芪提取物均有抗衰老、降低氧化应激水平的功能[14]，主要是通过清除多余的ROS 及改善线粒体功能障碍等途径，最终改善机体能量代谢[15]。本研究结果显示，黄芪改善了小鼠胚胎的发育能力，增强了抗氧化酶的活性，且减少了氧化代谢产物的减少，表明黄芪改善了衰老小鼠卵母细胞的氧化应激状态，增强了卵母细胞的抗氧化能力，促进受精卵的成熟。初步推测与相关基因上调有关。

褪黑素可通过降低生殖系统氧化应激、去除ROS及抗卵母细胞凋亡等途径实现改善小鼠生殖功能的作用，其主要功能蛋白为SOD2；同时，SOD2蛋白将体内代谢生成的超氧化物转变成过氧化物，在过程中产生的超氧阴离子和过氧化氢对卵泡发育也起到了关键作用[16]。体外培养的囊胚在黄芪的作用下，SOD1和SOD2基因表达增加，表明黄芪通过增加SOD 基因的表达也发挥了类似褪黑素的功能。目前，SOD1的功能尚不明确，但应注意卵丘细胞SOD1蛋白活性降低会导致体外受精－胚胎移植术（IVF－ET）成功率下降[17]，可推断黄芪可能会影响IVF －ET 的成功率，但仍需后续研究进一步证实。

综上所述，黄芪可能通过增强抗氧化基因的表达，降低衰老小鼠的全身氧化应激作用，改善其生殖功能，均为临床黄芪治疗卵巢衰老提供了理论基础。