细胞毒性T9细胞与肺癌相关性研究〔1〕

童金凤，张佳秀，江政松，孙午，刘晓峰

(九江市第一人民医院，江西 九江 332000)

肺癌是一种严重影响人类身体健康的呼吸道恶性肿瘤，五年生存率仅17%[1]。肺癌分为两类：小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。前者约占15%，后者约占85%，包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。吸烟和环境中的致癌物是肺癌的致病因素。CD8+T细胞也称细胞毒性T细胞、CTLs或Tc细胞，可以分化为Tc2，Tc9，Tc17和调节性CD8+T细胞[2]。恶性肿瘤的发生、发展与机体的免疫功能密切相关[3]。有研究表明[4]，Tc9细胞在抗肿瘤方面发挥着重要作用，我们通过研究肺癌患者外周血单个核细胞中的Tc9细胞比例及其相关细胞因子IL-9、主要细胞因子IL-9mRNA，以明确肺癌患者Tc9细胞的抗肿瘤作用，为下一步干预治疗和细胞治疗提供依据，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年1月—2019年6月收治的肺癌患者40 例，其中小细胞肺癌(SCLC组)20 例，男10 例，女10 例，年龄(51.65±13.88) 岁；非小细胞肺癌(NSCLC组)20 例(鳞癌8 例，腺癌12 例)，男10 例，女10 例，年龄(53.50±13.00) 岁。选择与患者性别、年龄相匹配的健康人20 例为健康对照组(对照组)，男10 例，女10 例，年龄(51.90±11.26) 岁。三组年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经院伦理委员会审核批准。

1.2 纳入标准和排除标准

纳入标准：有病理学明确诊断的肺癌患者；患者无其他肿瘤史。排除标准：患者伴发自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、风湿性骨关节病等；患者服用激素类药物或接受免疫抑制剂的治疗。

1.3 方法

1.3.1 试剂及仪器

CD3-FITC和CD8-PEIL-9 PerCP-cy5.5单抗(ebioscience公司)；IL-4，TGF-β1和IL-9 ELISA kit试剂盒(晶美公司)；破膜固定剂(BD公司)；FC500流式细胞仪(美国Beckman公司)；ST-360型酶标仪(科华生物)；cDNA反转录试剂盒(美国Applied Biosystems公司)；QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(美国Invitrogen公司)；DA7600扩增仪(达安基因)。

1.3.2 标本采集及处理

所有受检者均空腹抽取静脉血3 管，1 管EDTA抗凝用于流式细胞分析，另1 管EDTA抗凝用于IL-9mRNA检测，第3管分离血清，并分装至无核酶、无蛋白酶的EP管后立即放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.3 流式细胞检测Tc9细胞

采取血液制备单个核细胞(PBMC)，随后加入RPMI 1640培养基，采用佛波酯(PMA)和离子霉素在5%CO2浓度37 ℃刺激4 h后，加阻断剂Brefedlin A(BFA)或莫能霉素2 h以阻断高尔基体转运，使产生的细胞因子聚集于胞内，测定管加入抗人CD3-PE-cy5、抗人CD8-FTIC各5 μL，充分混匀，室温下置暗处20 min。加磷酸盐缓冲液1 mL震荡摇匀，离心5 min，倾去上清，洗涤3 次，加入150 μL破膜固定剂避光孵育40 min，离心取上清，洗涤加入抗人IL-9 PE单克隆抗体室温避光孵育30 min，磷酸盐缓冲液洗涤3 次备用。同时用FITC，PE和PE-cy5标记的抗人IgG抗体设置同型对照，用贝克曼库尔特FC500流式细胞仪上机检测。数据分析使用WinMDI2.9软件。

1.3.4 酶联免疫法检测肺癌患者血清细胞因子

将冰冻血清室温解冻，使用ELISA kit试剂盒测定IL-4，TGF-β1和IL-9浓度，所有操作严格参照说明书。

1.3.5 RNA提取及PCR仪检测IL-9mRNA

使用TRIzol试剂从PBMC中提取总RNA，采用cDNA反转录试剂盒进行cDNA合成，利用Quanti Tect SYBR Green PCR试剂盒进行扩增。引物序列为F：5′-GTGCCACTGCAGTGCTAATGT-3′，R：5′-CTCTCACTAAGCATGGTCTGG-3′。采用2-△△Ct方法计算IL-9 mRNA水平。在DA7600上采用如下设置反转录PCR：95 ℃下初始变性30 s，58 ℃下退火15 s，72℃下延伸15 s。然后在95 ℃ 5 s下35 个循环。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 三组IL-4和TGF-β1比较

SCLC组和NSCLC组的IL-4和TGF-β1显著高于对照组，差异有统计学意义(F值分别为105.6和4.86，P<0.05)；SCLC组和NSCLC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 三组IL-4和TGF-β1比较

2.2 三组Tc9细胞和IL-9及IL-9mRNA比

采用CD3/CD8设门，确定CD3+CD8+细胞，进一步分析CD3+CD8+细胞，CD3+CD8+IL-9+为Tc9细胞。与对照组比较，SCLC组和NSCLC组Tc9比例、IL-9及IL-9mRNA水平均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。SCLC组与NSCLC组此三项检测指标比较，差异均无统计学意义(F值分别为84.91，22.19和29.71，P>0.05)(见表2)。

表2 三组Tc9和IL-9及IL-9mRNA水平比较

2.3 SCLC组和NSCLC组患者Tc9细胞与IL-9和IL-9mRNA的相关性分析

相关性分析显示，SCLC组和NSCLC组患者Tc9细胞与IL-9呈显著正相关(r=0.882 7，P<0.0001)，Tc9细胞与IL-9mRNA呈显著正相关(r=0.834 6，P<0.001)(见图1、图2)。

图1 Tc9细胞与IL-9的相关性分析

图2 Tc9细胞与IL-9mRNA的相关性分析

3 讨 论

细胞免疫是机体抗击肿瘤的主要方式，CD8+T细胞是抗肿瘤的主要效应细胞，可识别肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合体Ⅰ(MHC-Ⅰ)类分子-肿瘤抗原肽复合物，通过溶细胞作用，直接杀伤肿瘤细胞，也可通过分泌多种细胞因子如γ-干扰素(INF-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)间接杀伤肿瘤细胞。CD8+原始T细胞在TGF-β诱导下向调节性CD8+T细胞分化，IL-4诱导其向Tc2细胞分化，在TGF-β和IL-6共同作用下分化为Tc17细胞，Tc9细胞的发育、分化则由TGF-β和IL-4诱导[5]。本研究中TGF-β1在肺癌中增高，这与相关研究结果相同[6]。IL-4水平在肺癌中增高，IL-4作为一种炎症因子，可以诱导肺癌细胞中15羟基前列腺素脱氢酶表达[7]。有研究表明[8-9]Tc9细胞在过敏性皮炎、抗肿瘤方面有着重要作用。尽管如此，Tc9细胞在肺癌中的作用却鲜有研究。

Tc1细胞通过分泌IFN-γ和细胞毒因子如GrzB和穿膜蛋白杀死肿瘤细胞，而分泌IL-9的Tc9细胞比Tc1细胞起更重要作用[8]。本研究结果显示，小细胞肺癌和非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中Tc9细胞均显著更高，这表明Tc9细胞参与到了肺癌的病理变化中。除此之外，肺癌患者外周血PBMC中IL-9mRNA和血清IL-9均显著增高，IL-9是一种受体属γ链家族的细胞因子，具有直接和间接作用的多重免疫调节效应，最近因产IL-9的Th9细胞而重新引起人们的注意[10]。IL-9可来源于调节性T细胞Treg、辅助性T细胞Th2、辅助性T细胞Th17、辅助性T细胞Th9等多种细胞[11]。有研究表明，Tc9细胞分泌的IL-9较IFN-γ在抗肿瘤方面有更重要作用[4]，IL-9可抑制小鼠鳞癌的生长[12]，亦可促进CTL细胞抗原的启动并进入肺癌组织发挥抗肿瘤作用[13]。本研究显示显著增高的IL-9及其mRNA和Tc9细胞相关，Tc9细胞和IL-9可能相互作用发挥了抗击肺癌的过程。

综上所述，Tc9细胞参与了肺癌的病理变化，而这种变化可能是通过分泌细胞因子IL-9实现的。