miR-363-3p靶向PIK3CA调节非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭和迁移

朱茜文 安海燕 张亚平

(平顶山市第二人民医院呼吸内科,平顶山 467000)

肺癌是世界范围内患病率较高的癌症之一，根据肿瘤细胞微观形态， 可分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC是肺癌最主要的类型，占比超过85%[1]。尽管NSCLC治疗取得了一定进展，但很多NSCLC患者确诊时已是晚期，只有不到18%患者存活超过5年[2]。miRNA是一类短链非编码RNA，通过转录后调控，在细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中扮演重要角色，在人类疾病中起重要作用，已有研究报道不同miRNA在包括NSCLC在内的各种癌症中起促癌或抑癌的作用，具有作为癌症生物标志物和治疗靶点的应用前景[3-5]。miR-363-3p是近年鉴定出的肿瘤抑制基因，在包括肝癌、乳腺癌、胃癌、直肠结肠癌等诸多癌症中均报道其通过靶向作用于关键基因调控肿瘤生长和转移。文献报道miR-363-3p在肺癌中可通过靶向作用于增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抑制肿瘤生长，但作用机制尚不明确[6]。本研究通过培养人NSCLC细胞A549，并转染miR-363-3p和磷脂酰肌醇激酶-3催化亚单位(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha polypeptide gene,PIK3CA)过表达载体，从细胞水平初步探究NSCLC细胞中miR-363-3p与PIK3CA的调控关系及作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 DMEM细胞培养液、胎牛血清购自美国Hyclone公司，lipofectamine 2000购自美国Thermo Fisher公司，青链霉素、Trizol试剂、RIPA试剂、CCK8试剂购自上海碧云天生物技术研究所，BCA试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，miR-363-3p mimic、阴性对照mimic、PIK3CA重组表达载体(pcDNA 3.1-PIK3CA,pc-PIK3CA)由上海吉玛制药技术有限公司合成，所用引物由上海生工生物公司合成，反转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix购自日本Takara公司，荧光素酶报告系统购自美国Promega公司，PIK3CA、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1蛋白、AKT、p-AKT抗体购自英国Abcam公司。人NSCLC细胞A549细胞株购自美国ATCC公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 在加入10%胎牛血清、100 mg/ml链霉素、100 U/ml青霉素的DMEM细胞培养液中培养细胞，培养条件为5%CO2、37℃。

1.2.2分组及处理方法 细胞分为mimic NC、miR-363-3p、pc-PIK3CA、miR-363-3p+pc-PIK3CA组，根据lipofectamine 2000说明书，阴性对照mimic转染mimic NC组细胞，miR-363-3p转染miR-363-3p组细胞，pc-PIK3CA转染pc-PIK3CA组细胞，miR-363-3p和pc-PIK3CA共转染miR-363-3p+pc-PIK3CA组细胞，转染24 h，用于后续实验。

1.2.3RT-PCR检测 Trizol试剂提取细胞或组织RNA，反转录获得cDNA，按照SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书检测mRNA及miRNA水平，扩增条件为95℃预变性2 min，95℃ 5 s、60℃ 10 s，40个循环，2-ΔΔCt法计算RNA相对表达水平。

1.2.4荧光素酶报告基因实验 根据生物信息学预测，扩增PIK3CA 3′-UTR区域，构建pGL3 luciferase promoter野生型(WT)和突变型(MUT)载体，载体和miR-363-3p或阴性对照mimic成功转染HEK293细胞，转染48 h后按照双荧光素酶报告分析试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.2.5Western blot检测 RIPA试剂提取细胞总蛋白并通过BCA试剂盒定量，30 μg/孔点样，10 % SDS-PAGE电泳分离蛋白，半干转膜法转膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入适量一抗4℃孵育过夜，PBS清洗后加入二抗室温孵育2 h，ECL显影。

1.2.6CCK8法检测细胞增殖 常规条件培养细胞，每隔1 d CCK8试剂测定细胞增殖倍数，连续3 d。将细胞接种于96孔板，10 μl/孔加入CCK8试剂处理4 h，酶标仪测定450 nm吸光值。

1.2.7划痕愈合法检测细胞迁移 细胞接种于6孔板，培养细胞至铺满板底80%后，中枪头对细胞垂直水平画线并通过PBS清洗，常规培养环境下继续培养24 h后观察拍照。

1.2.8Transwell法检测细胞侵袭 Transwell小室加入50 μl基质胶并于37℃凝固，上室加入无血清培养液，下室加入完全培养液，将细胞接种于小室上室，常规条件下培养48 h，清洗掉未过膜的细胞，多聚甲醛固定剩余细胞，结晶紫染色观察拍照。

2 结果

2.1肿瘤组织中miR-363-3p表达量下调 对20例正常肺组织和NSCLC组织临床样本进行检测，与正常肺组织相比，NSCLC组织中miR-363-3p表达水平显著降低(P<0.01)，提示miR-363-3p可能参与NSCLC发展进程，见图1A。

2.2肿瘤组织中PIK3CA和miR-363-3p表达相关性 与正常肺组织相比，NSCLC组织PIK3CA mRNA水平显著升高(P<0.01)，见图1B。Spearman相关分析表明miR-363-3p和PIK3CA基因表达水平呈负相关，见图2。

2.3miR-363-3p靶向作用于PIK3CA 根据生物信息学分析预测miR-363-3p和PIK3CA靶向作用位点，与WT PIK3CA+mimic NC组相比，WT PIK3CA+miR-363-3p组荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，MUT PIK3CA+mimic NC组和MUT PIK3CA+miR-363-3p组差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

2.4miR-363-3p抑制PIK3CA基因表达 与A549空白对照组比较，mimic NC组中miR-363-3p表达差异无统计学意义，与mimic NC组相比，miR-363-3p组miR-363-3p表达水平显著升高(P<0.01)，表明A549细胞成功转染miR-363-3p。与mimic NC组比较，miR-363-3p组细胞PIK3CA基因表达显著降低(P<0.01)，pc-PIK3CA组细胞PIK3CA基因表达显著升高(P<0.01)；与pc-PIK3CA组相比，miR-363-3p+pc-PIK3CA组细胞PIK3CA基因表达显著降低(P<0.01)，见图4。与mimic NC组相比，miR-363-3p组PIK3CA蛋白表达显著降低(P<0.01)，pc-PIK3CA组PIK3CA蛋白表达显著升高(P<0.01)；与pc-PIK3CA组相比，miR-363-3p+pc-PIK3CA组PIK3CA蛋白表达显著降低(P<0.01),见图5。

图1 RT-PCR检测正常肺组织、NSCLC组织miR-363-3p、PIK3CA表达Fig.1 Expressions of miR-363-3p and PIK3CA in normal tissues and NSCLC tissues by RT-PCR

图2 NSCLC组织miR-363-3p和PIK3CA基因表达相关性分析Fig.2 Correlation analysis of miR-363-3p and PIK3CA gene expressions in NSCLC tissues

2.5miR-363-3p抑制肿瘤细胞增殖 与mimic NC组相比，miR-363-3p组A549细胞增殖水平显著降低，pc-PIK3CA组细胞增殖水平显著升高(P<0.01)；与pc-PIK3CA组相比，miR-363-3p+pc-PIK3CA组细胞增殖水平显著降低(P<0.01)，见图6。

图3 荧光素酶报告实验检测miR-363-3p和PIK3CA靶向关系Fig.3 Relationship between miR-363-3p and PIK3CA by luciferase reporter assay

图4 RT-PCR检测A549细胞miR-363-3p、PIK3CA mRNA表达水平Fig.4 Expression level of miR-363-3p in A549 cells by RT-PCR

图5 Western blot检测A549细胞PIK3CA蛋白表达Fig.5 Protein expression of PIK3CA in A549 cells by Western blot

图6 CCK8法检测A549细胞增殖倍数Fig.6 CCK8 assays for measuring cell growth of A549 cells

图7 划痕愈合法检测A549细胞迁移能力Fig.7 Wound healing test for migration ability of A549 cells

2.6miR-363-3p抑制肿瘤细胞侵袭和迁移 与mimic NC组相比，miR-363-3p组A549细胞划痕愈合率和侵袭细胞数目均显著降低，pc-PIK3CA组显著升高(P<0.01)；与pc-PIK3CA组相比，miR-363-3p+pc-PIK3CA组细胞划痕愈合率和侵袭细胞数目显著降低(P<0.01)，见图7,8。

图8 Transwell检测A549细胞侵袭能力Fig.8 Transwell test for invasion ability of A549 cells

图9 Western blot检测A549细胞增殖、转移及PI3K/AKT通路关键蛋白表达Fig.9 Western blot for protein expression of and PI3K/AKT pathway proliferation,metastasis in A549 cells

2.7miR-363-3p对增殖和转移相关蛋白及PI3K/AKT信号通路蛋白表达的调控 与mimic NC组相比，miR-363-3p组A549细胞E-cadherin蛋白表达显著升高，N-cadherin、Cyclin D1蛋白表达显著降低，p-AKT/AKT比率显著降低(P<0.01)，pc-PIK3CA组A549细胞E-cadherin蛋白表达显著降低，N-cadherin、Cyclin D1蛋白表达显著升高，p-AKT/AKT比率显著升高(P<0.01)；与pc-PIK3CA组比较，miR-363-3p+pc-PIK3CA组A549细胞E-cadherin蛋白表达显著升高，N-cadherin、Cyclin D1蛋白表达显著降低，p-AKT/AKT比率显著降低(P<0.01)，见图9。

3 讨论

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3Ks)家族来源于细胞内的磷脂酰肌醇激酶家族，可分为3个类型，其中研究最多的是Ⅰ类PI3K，可在体内催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇转化为3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate,PIP3)，在细胞增殖、生长、运动、代谢、生存及炎症反应等生理过程中起关键作用[7,8]。I类PI3K是异源二聚体，由调节亚基p85和催化亚基p110组成，p85亚基包含SH2和SH3结构域，在缺乏激活信号时，p85抑制p110催化活性，当包含对应结合位点的受体酪氨酸激酶或接头蛋白与p85相互作用，使PI3K被募集到质膜部位，p110催化活性抑制被解除，参与PIP3催化合成[9]。PIK3CA基因编码Ⅰ类PI3K的p110催化p110α，在包括NSCLC在内的各种癌症中均有起促癌作用[10-12]。miR-363-3p是新鉴定出的肿瘤抑制miRNA，Wang等[6]报道miR-363-3p在肺腺癌中的抑癌作用，Liu等[13]报道 miR-363-3p可通过靶向作用于PIK3CA，抑制乳头状甲状腺癌的增殖，推测在NSCLC中miR-363-3p的抑癌作用与PIK3CA相关。本研究对临床NSCLC样本进行检测，发现miR-363-3p在NSCLC组织中表达下调，PIK3CA基因表达上调，且密切相关。同时，荧光素酶报告基因实验证实miR-363-3p与PIK3CA的靶向作用，表明miR-363-3p可通过靶向作用于PIK3CA抑制PIK3CA表达。此外，本研究进一步构建PIK3CA过表达细胞株，并对细胞中的基因和蛋白表达进行检测，发现miR-363-3p可显著降低PIK3CA的基因和蛋白表达，与之前结果相符。

PI3K/AKT信号通路在调节细胞生长代谢中发挥关键作用，在各种癌症中PI3K/AKT信号通路都可能发生异激活，因此该通路在肿瘤治疗中常被作为靶向治疗位点之一[14,15]。当PI3K诱发PIP3生成后，PIP3与细胞内包含PH结构域的AKT和磷脂酰激酶依赖性蛋白激酶1(phosphoinositide dependent kinase-1,PDK1)结合，参与诱导AKT激活，活化的AKT可通过磷酸化下游因子，调控增殖、凋亡及迁移等一系列细胞生长过程[16]。研究表明PIK3CA可通过PI3K/AKT信号通路促进NSCLC细胞增殖、侵袭与迁移，而部分miRNA如miR-1、miR-142-5p可通过靶向作用于PIK3CA抑制肿瘤生长[12,17]。本研究发现miR-363-3p可显著抑制AKT激活，并抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭与迁移，PIK3CA过表达可抵消miR-363-3p对NSCLC细胞的影响。同时，miR-363-3p可显著降低N-cadherin和Cyclin D1表达，提升E-cadherin表达，PIK3CA可抵消miR-363-3p对以及蛋白表达的影响。E-cadherin主要介导细胞间黏附反应，维持上皮细胞形态，N-cadherin主要存在于间叶细胞，与E-cadherin作用相反，两者常用作衡量肿瘤细胞转移能力的标志物[18]。Cyclin D1是细胞周期的调控基因，其表达与细胞周期的转换时间相关，可反映细胞增殖水平[19]。上述实验结果表明miR-363-3p可通过下调PIK3CA表达，抑制NSCLC细胞增殖、侵袭和转移。

综上所述，miR-363-3p可靶向作用于PIK3CA降低PIK3CA表达，抑制PI3K/AKT信号通路激活，从而抑制NSCLC细胞增殖、侵袭和迁移。本研究从细胞水平初步探究NSCLC中miR-363-3p对PIK3CA的靶向作用及其对NSCLC细胞的影响，尚存不足，需要通过移植肿瘤动物模型等方法进一步验证miR-363-3p在体内的作用。