ANXA 2、STAT 3、VEGF在乳腺癌中的表达及与肿瘤转移的关系△

李建丽，李永梅，康鸿斌，王霞

内蒙古医科大学附属医院甲乳外科，呼和浩特010050

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年升高及年轻化趋势[1]。目前，早期乳腺癌患者的治疗效果较好，预后良好，但晚期乳腺癌患者的病死率较高、预后较差[2]，故抑制乳腺癌转移成为治疗乳腺癌的重要靶点之一。膜联蛋白A2（annexin A2，ANXA2）是annexins家族成员之一，研究显示，ANXA2在侵袭转移性强的恶性肿瘤中表达水平较高，其异常表达可能与肿瘤细胞转移密切相关[3]。信号转导与转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）是一种在哺乳动物细胞中广泛表达的转录因子，可参与细胞因子和生长因子介导的信号传递过程[4]。研究发现，由STAT3介导的信号异常出现在头颈部癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌和多发性骨髓瘤等多种恶性肿瘤中[5-6]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种直接作用于血管内皮细胞的生长因子，具有强大的促进内皮细胞增殖和诱导新生血管生成的作用，而肿瘤细胞生长和转移与新生血管生成密切相关[7]。然而，目前有关乳腺癌转移的相关分子生物学机制尚不清楚。因此，本研究对ANXA2、STAT3、VEGF在乳腺癌中的表达情况进行分析，并探讨其与乳腺癌转移的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年5月至2019年5月内蒙古医科大学附属医院收治的女性乳腺癌患者。纳入标准：①均经组织病理学检查确诊为乳腺癌；②均为初诊患者；③既往均未接受过放化疗治疗；④临床资料完整。排除合并急性感染性疾病、血液系统疾病、免疫系统疾病及其他恶性肿瘤的患者。依据纳入和排除标准，本研究共纳入98例女性乳腺癌患者，年龄33～76岁，中位年龄51岁；绝经56例，未绝经42例；病理类型：浸润性导管癌72例，导管内癌26例；淋巴结转移43例，无淋巴结转移55例；TNM分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期44例，Ⅲ期26例；远处转移12例，无远处转移86例；人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表达阳性24例，HER2表达阴性74例；上皮钙黏素（E-cadherin）表达阳性47例，E-cadherin表达阴性51例；神经钙黏素（N-cadherin）表达阳性53例，N-cadherin表达阴性45例；基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）表达阳性 38例，MMP2表达阴性60例；MMP9表达阳性41例，MMP9表达阴性51例。取98例乳腺癌患者的乳腺癌组织及相应的癌旁正常组织作为检测样本，经焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水清洗、拭干后，立即放入液氮中，并于-80℃冰箱保存待测。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂和仪器Trizol试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，Prime Script™逆转录酶试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM实时定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒均购自日本Takara公司，实时定量PCR仪购自美国ABI公司，Nanodrop 200超微量分光光度计购自美国Thermo Fisher公司，ANXA2、STAT3、VEGF引物由中国生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。

1.2.2 实时定量RT-PCR检测ANXA 2、STAT 3、VEGFmRNA的相对表达量 依据Trizol试剂盒操作说明书提取组织总RNA，DEPC水解，采用Nanodrop 2000超微量分光光度计检测总RNA的纯度及浓度，再应用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。参照PrimeScript™逆转录酶试剂盒操作说明书进行反转录获得cDNA，反应体系为20 μl，反应条件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃5 min，-20℃保存待用。ANXA2上游引物5'-GCCATCAAGACCAAAGGTGT-3'，下游引物5'-TCAGTCTGATGCAAGTTCC-3'；STAT3上游引物5'-CCAGTCAGTGACCAGGCAGAAG-3'，下游引物5'-GCACGTACTCCATCGCTGACA-3'；VEGF上游引物 5'-GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3'；5'-GTGCTGACGC-TAACTGACC-3'；以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，GAPDH上游引物 5'-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3'，下游引物 5'-ATGATCTT2GAGGCTGTTGTCATA-3'。参照实时定量RT-PCR试剂盒操作说明书，反应体系为25 μl，反应条件：95℃预变性30 s，95℃退火5 min，60 ℃延伸30 s，40个循环。以采用2－△△Ct方法计算ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相对表达量，每组取3个复孔均值，根据各样本的平均Ct值和ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH），计算2-ΔΔC（tΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCtGAPDH），其数值表示目的基因相对于内参基因的相对倍数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.00软件对所有数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，相关性分析采用Pearson相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织和癌旁正常组织中ANXA 2、STAT 3、VEGF mRNA相对表达量的比较

乳腺癌组织中ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相对表达量均明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

2.2 乳腺癌组织中ANXA 2、STAT 3、VEGF的相关性

乳腺癌组织中ANXA2与STAT3、VEGF的表达均呈正相关（r=0.571、0.522，P＜0.05），STAT3与VEGF的表达呈正相关（r=0.604，P＜0.05）。

2.3 不同临床特征乳腺癌患者乳腺癌组织中ANXA 2、STAT 3、VEGF mRNA相对表达量的比较

不同年龄、绝经情况、病理类型的乳腺癌患者乳腺癌组织中ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同TNM分期、淋巴结转移情况、远处转移情况、HER2表达情况、E-cadherin表达情况、N-cadherin表达情况、MMP2表达情况和MMP9表达情况乳腺癌患者乳腺癌组织中ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表1 乳腺癌组织和癌旁正常组织中ANXA 2、STAT 3、VEGF mRNA相对表达量的比较

表2 不同临床特征乳腺癌患者乳腺癌组织中ANXA 2、STAT 3、VEGF mRNA的相对表达量

3 讨论

乳腺癌是威胁女性生命健康的常见恶性肿瘤之一。尽管随着医疗技术的快速发展，乳腺癌患者的生存期及预后得到了明显改善，但晚期乳腺癌患者的生存期及预后仍然较差[8]。远处转移是影响乳腺癌患者预后的重要因素，也是导致患者病死的主要原因[9]。因此，抑制乳腺癌患者肿瘤细胞的远处转移对改善患者的预后有重要意义。肿瘤细胞可以通过不同途径转移至邻近或远处的组织器官，进而形成新的继发肿瘤灶[10]。目前研究发现，在肿瘤细胞转移过程中，抑癌基因的失活、突变及原癌基因的异常表达可能诱发或促进肿瘤细胞的转移[11]。

ANXA2蛋白是一种可调节纤溶酶原活化系统的蛋白质，而纤溶酶原活化系统与多种生物学活动，如血管生成、细胞外基质降解、MMP及生长因子的活化有关，均有助于肿瘤的侵袭转移[12-13]。研究显示，ANXA2在胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和前列腺癌等恶性肿瘤中均表达上调，特别在侵袭转移性强的恶性肿瘤中，表明ANXA2的异常表达可能与肿瘤细胞的转移密切相关[14-15]。STAT3是STAT家族最重要的成员，参与细胞因子和生长因子介导的信号转导，其在头颈部癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌得多种恶性肿瘤中发挥致癌作用[16]。研究显示，STAT3可以调控影响细胞周期进程或抑制细胞凋亡的因子，如cyclin家族及MMP家族等[17]。STAT3还可调控肿瘤细胞VEGF的表达[18]，而VEGF具有强大的促进内皮细胞增殖和新生血管生成的作用，其是血管生成的重要因素之一，而肿瘤细胞生长和转移与新生血管生成密切相关[19]，抑制STAT3的表达可能有助于阻止肿瘤血管生成和转移。但目前有关乳腺癌转移的相关分子生物学机制尚不清楚，有关ANXA2、STAT3、VEGF在乳腺癌组织中的表达情况及与乳腺癌转移关系的研究也较少。

本研究结果显示，乳乳腺癌组织中ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相对表达量均明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.05），与Chen等[20]和Yuan等[21]的研究结果一致，表明ANXA2、STAT3、VEGF在乳腺癌组织中的表达上调。此外乳腺癌组织中ANXA2与STAT3、VEGF的表达均呈正相关，STAT3与VEGF的表达呈正相关，表明三者之间存在紧密的相互作用关系。本研究结果显示，不同TNM分期、淋巴结转移情况、远处转移情况、HER2表达情况、E-cadherin表达情况、N-cadherin表达情况、MMP2表达情况和MMP9表达情况乳腺癌患者乳腺癌组织中ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。这可能是因为E-cadherin表达下调、N-cadherin表达上调可促进上皮-间充质转化，而上皮-间充质转化又与肿瘤细胞转移密切相关[22]，同时，MMP2、MMP9能降解血管基底膜和细胞外基质中的胶原成分，促成肿瘤细胞向远处转移[23]，表明ANXA2、STAT3、VEGF表达上调与乳腺癌细胞的远处转移密切相关。值得注意的是，HER2阳性表达乳腺癌患者乳腺癌组织中ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相对表达量均高于HER2阴性表达患者，这可能是因为HER2阳性表达（过表达或扩增）的乳腺癌患者恶性程度高、进展快速、易转移[24]，间接表明ANXA2、STAT3、VEGF表达上调可能与HER2阳性乳腺癌的转移有关。

综上所述，ANXA2、STAT3、VEGF在乳腺癌组织中表达上调，且与乳腺癌的转移密切相关。