T 淋巴细胞亚群、MMP 9、MMP 2在原发性肺癌中的表达及临床意义△

张辉，吴秋歌，张坤，李立敬，朱静静，李艳娟，王静

郑州大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，郑州450000

原发性肺癌（primary lung cancer，PLC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率较高，非小细胞肺癌为其最常见的一种类型[1-2]。早期肺癌无典型症状，大部分患者就诊时已进展至中晚期或伴远处转移，失去了最佳治疗时机，预后差[3]。近年来，T淋巴细胞介导的细胞免疫在肿瘤发病过的程中起关键作用[4]。细胞免疫是机体拮抗肿瘤的关键免疫机制；T淋巴细胞是细胞免疫的重要效应细胞，其功能和数量发生异常时可能导致机体免疫调节功能紊乱，抗肿瘤能力降低，更易出现侵袭、转移[5]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是锌离子依赖性蛋白水解酶，参与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的降解过程[6]。肿瘤细胞与ECM的相互作用在肿瘤的发病及进展中起关键作用[7]。MMP2、MMP9过表达与多种恶性肿瘤的发生密切相关[8-9]。关于PLC发病过程中T淋巴细胞亚群、MMP2、MMP9水平变化与肿瘤恶性生物学行为的关系的报道较少。本研究通过对PLC患者的外周血淋巴细胞亚群及血清MMP2、MMP9水平进行检测，以期为PLC的诊疗提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年2月至2019年3月郑州大学第一附属医院收治的PLC患者。纳入标准：①经组织病理学检查确诊为肺癌；②未接受放疗、化疗、手术或靶向抗肿瘤治疗；③临床分期和组织学分型均依据国际肺癌研究协会制定的肺癌TNM分期标准（第8版）修订建议[10]；④临床资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并重要脏器功能障碍；③合并全身系统性炎症性疾病；④合并急性、慢性感染；⑤合并血液系统疾病；⑥合并严重脑血管疾病；⑦合并严重精神类疾病；⑧合并自身免疫性疾病。根据纳入和排除标准，本研究共纳入89例PLC患者作为PLC组，其中，男58例，女31例；年龄32～79岁，平均（60.95±10.52）岁；病理类型：鳞癌56例，腺癌27例，小细胞癌6例。选取同期体检的30例健康者作为对照组，均经体检证实心、肝、肺、肾功能正常，其中，男19例，女11例；年龄30～78岁，平均（59.55±11.52）岁。

1.2 检测方法

PLC组患者于入院次日、对照组受试者于体检当日均采集外周空腹静脉血约5 ml，离心分离后低温保存待测。采用购自美国贝克曼库尔特公司的DxFLEX型流式细胞仪测定外周血中T淋巴细胞亚群水平，血样标本制成单细胞悬液（1×106/ml），恒温水浴速溶，离心沉淀，弃去枸橼酸缓冲液和上清，加入10 μl异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记鼠抗人单克隆抗体或藻红蛋白（phycoerythrin，PE）荧光素标记免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）抗体，离心混匀，避光反应0.5 h，离心后弃上清，加入含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液3 ml，离心混匀，弃上清，再次加入磷酸盐缓冲液2 ml，混匀后上流式细胞仪测定，计数细胞10 000个，以同型抗体作为阴性对照。采用酶联免疫吸附试验法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定血清中MMP9、MMP2水平，ELISA试剂盒购自美国R&D公司，均严格按试剂使用说明操作，采用购自美国Thermo公司的多功能酶标仪读取各孔吸光度值，应用电脑自动计算血清MMP9、MMP2浓度。所有血液样本均检测1次，各试剂批内变异系数＜5%，批间变异系数＜13%，符合精密度要求。

1.3 观察指标

比较两组受试者外周血中的T淋巴细胞亚群CD3-CD19+、CD8+CD28+水平及血清中 MMP9、MMP2水平，分析上述指标在不同病理特征PLC患者中的表达差异；分析PLC患者外周血中T淋巴细胞亚群水平与血清中MMP9、MMP2水平的相关性；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析T淋巴细胞亚群、MMP9、MMP2水平对PLC发生远处转移的预测价值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用完全设计随机方差分析；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；相关性分析采用Pearson直线相关分析法；采用ROC曲线分析T淋巴细胞亚群、MMP9、MMP2水平对PLC发生远处转移的预测价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者外周血中 T淋巴细胞亚群及血清中MMP 9、MMP 2水平的比较

PLC组患者外周血中CD3-CD19+、CD8+CD28+水平均明显低于对照组受试者，血清中MMP9、MMP2水平均明显高于对照组受试者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 两组受试者外周血中 T淋巴细胞亚群及血清MMP 9、MMP 2水平的比较（±s）

表1 两组受试者外周血中 T淋巴细胞亚群及血清MMP 9、MMP 2水平的比较（±s）

组别CD3-CD19+CD8+CD28+MMP9MMP2（%） （%） （μg/ml） （μg/ml）PLC组（n=89）42.76±5.7912.75±2.65135.52±25.98437.52±61.44对照组（n=30）50.16±6.5817.63±3.7189.78±14.65324.15±50.63 t值5.8468.2919.1489.110 P值 ＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

2.2 不同病理特征PLC患者外周血中 T淋巴细胞亚群及血清中MMP 9、MMP 2水平的比较

不同病理类型PLC患者外周血中T淋巴细胞亚群及血清中MMP9、MMP2水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同N分期PLC患者血清中的MMP9、MMP2水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。Ⅲ～Ⅳ期、低分化、N1～3期、M1期的PLC患者外周血中CD3-CD19+水平均明显低于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、N0期、M0期的患者，差异均有统计学意义（t=4.732、5.446、4.174、5.023，P＜0.01）；Ⅲ～Ⅳ期、低分化、N1～3期、M1期的 PLC 患者外周血中CD8+CD28+水平均明显低于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、N0期、M0期的患者，差异均有统计学意义（t=6.759、6.077、4.456、7.408，P＜0.01）。Ⅲ～Ⅳ期、低分化、M1期的PLC患者外周血中MMP9水平均明显高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、M0期的患者，差异均有统计学意义（t=5.955、3.891、3.556，P＜0.01）；Ⅲ～Ⅳ期、低分化、M1期的PLC患者外周血中MMP2水平均明显高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、M0期的患者，差异均有统计学意义（t=14.245、9.432、10.812，P＜0.01）。（表2、表3）

表2 89例不同病理特征PLC患者的外周血 T淋巴细胞亚群水平

表389 例不同病理特征PLC患者的血清MMP 9、MMP 2水平

2.3 PLC患者外周血中 T淋巴细胞亚群与血清中MMP 9、MMP 2水平的相关性分析

相关性分析结果显示，PLC患者外周血中CD3-CD19+、CD8+CD28+水平与血清中 MMP9、MMP2水平均呈负相关（P＜0.05）。（表4）

表4 89例PLC患者外周血 T淋巴细胞亚群与血清MMP 9、MMP 2水平的相关性分析

2.4 PLC患者外周血 T淋巴细胞亚群与MMP 9、MMP 2水平对PLC远处转移的预测价值

ROC曲线分析发现，MMP9水平对PLC发生远处转移的预测价值最高，约登指数最大时对应的cut-off值＞143.14，曲线下面积（area under curve，AUC）为 0.93，灵敏度、特异度分别 为86.67%、88.14%；其次为CD3-CD19+，约登指数最大时对应的cut-off值＜40.50，AUC为0.91，灵敏度、特异度分别为96.67%、81.36%。（表5）

表5 89例PLC患者外周血 T淋巴细胞亚群与血清MMP 9、MMP 2水平对PLC远处转移的预测价值

3 讨论

T淋巴细胞是参与机体肿瘤免疫反应的重要细胞，已被证实其可调控机体的抗肿瘤免疫反应[11]。CD3抗原是成熟T淋巴细胞表面特异性抗原，表达于人T淋巴细胞表面，含多种肽链，可与T淋巴细胞识别抗原受体形成复合物，传递活化信号至T淋巴细胞内部[12]。CD19为分布于成熟B淋巴细胞表面的抗原，其与CD3抗原组成共同代表体内T淋巴细胞总数目[13]。CD8分子分布于杀伤性T淋巴细胞与抑制性T淋巴细胞表面，CD28位于外周成熟细胞毒性T细胞表面，CD8+和CD28+共同组合成细胞毒性T淋巴细胞亚群，调控肿瘤细胞免疫，主要通过与靶细胞结合释放大量细胞杀伤因子，促进肿瘤细胞坏死，并起到杀灭肿瘤细胞的作用[14]。研究发现，恶性肿瘤的发生、发展与细胞免疫功能低下密切相关[15-16]。T淋巴细胞亚群作为介导机体抗肿瘤免疫反应的关键细胞因子，可能能够作为肿瘤患者免疫系统紊乱研究的新靶点[17]。本研究发现，PLC 患者的CD3-CD19+、CD8+CD28+水平均明显低于健康者，提示PLC患者存在明显的细胞免疫低下的表现，且随着临床分期的上升、肿瘤分化程度的降低，CD3-CD19+、CD8+CD28+水平降低得更明显；同时发生远处转移的PLC患者的CD3-CD19+、CD8+CD28+水平明显低于未发生远处转移的患者，进一步提示PLC具有明显的免疫抑制的特点，且随着肿瘤恶性程度的增加，患者的免疫抑制特点更明显，推测免疫系统紊乱与PLC的发生、发展有关。进一步的ROC曲线分析结果发现，CD3-CD19+、CD8+CD28+对PLC发生远处转移均有较高的预测价值，可为监测PLC病情进展提供重要依据。

浸润、转移是恶性肿瘤典型的生物学特点，也是肿瘤致死的重要原因[18]。ECM降解是肿瘤浸润、转移的关键环节[19]。MMP9、MMP2均为明胶酶类分子，由可能存在恶性倾向的肿瘤细胞、巨噬细胞分泌，共同参与ECM降解过程，破坏基底膜完整性，在恶性肿瘤的血管化、肿瘤细胞的浸润及转移灶的形成过程中起重要作用[20-21]；同时，MMP9、MMP2可促成肿瘤新生血管形成，导致血管局部基底膜降解，创造促血管生成微环境，促成肿瘤细胞的侵袭、转移[22]。本研究发现，PLC患者的血清MMP9、MMP2水平均明显高于对照组；Ⅲ～Ⅳ期、低分化、发生远处转移（M1期）的PLC患者的血清MMP9、MMP2水平均明显高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、未发生远处转移（M0期）的患者，这与陈鹏等[23]和Zergoun等[24]的结论相同，证实MMP2、MMP9均与PLC的发生和发展有关。此外，本研究发现，外周血T淋巴细胞亚群与血清MMP9、MMP2水平对PLC是否发生远处转移均有较高的预测价值。另外，相关性分析发现，PLC患者的外周血CD3-CD19+、CD8+CD28+与血清MMP9、MMP2水平均呈负相关，推测外周T淋巴细胞亚群与MMP可能协同参与PLC发病、浸润、转移的过程。考虑其原因为在巨噬细胞、肺泡上皮细胞炎症浸润的刺激下，趋化因子、免疫细胞向肺组织浸润，加重肺部炎性反应，而炎症信号可激活肿瘤细胞及外周组织释放大量的MMP进入血液循环，通过正向反馈作用进一步促进炎症、趋化因子和免疫细胞的浸润，促使ECM降解，同时导致机体出现免疫耐受，更有利于肿瘤细胞的浸润、增殖和迁移，导致肿瘤恶性表型发生转化[25]。

综上所述，外周血T淋巴细胞亚群、MMP9、MMP2可能协同参与PLC的发病及进展，其水平与PLC患者的临床分期、分化程度、远处转移情况密切相关，可作为预测PLC是否发生远处转移的重要依据。但是，本研究为回顾性分析，存在一定的局限性，且观察时间短，样本量少，尚未分析以上因子对PLC预后的影响，且尚未研究PLC患者MMP组织抑制因子-1的表达情况及其与以上因子的关系，有待扩充样本量、延长随访时间进一步研究。