长链非编码RNA作为食管癌潜在的预后生物标志物的系统评价及荟萃分析△

杨俊强，李文耀，张策，杨义平，高社干

河南科技大学临床医学院/河南科技大学第一附属医院肿瘤内科/河南科技大学肿瘤研究所/河南省肿瘤表观遗传重点实验室，河南 洛阳4710030

食管癌的发病率居全部恶性肿瘤的第8位，病死率居全部恶性肿瘤的第6位[1]。食管癌的病理类型主要包括鳞状细胞癌和腺癌，中国约90%的食管癌为食管鳞状细胞癌[2]。目前主要通过临床分期和病理分级判断食管癌患者的预后，但相同临床病理特征的食管癌患者也可能出现不同的预后[3]。因此寻找食管癌潜在的预后生物标志物显得尤为重要。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类转录本超过200个碱基的RNA分子，且不能编码蛋白质[4]。最初lncRNA被当作转录过程中的“噪声”未受到关注。随着研究的不断深入，研究者们发现lncRNA参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学过程[5]。因此lncRNA可能在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用[6]。尽管目前不少研究表明lncRNA可能作为食管癌潜在的预后生物标志物，但这些研究存在样本量小、数据离散等局限性。本研究采用系统评价和荟萃分析的方法，评估lncRNA表达情况与食管癌患者预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 检索策略

在PubMed、Embase、Web of Science、中国知网和万方数据库中检索相关文献。检索日期截至2019年9月10日。检索关键词为“lncRNA”“食管癌”。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：①病理诊断为食管癌；②lncRNA的检测样本来源于组织或血清；③研究分析了lncRNA表达水平与食管癌患者预后的关系；④具有生存分析相关的风险比（hazard ratio，HR）及95%置信区间（confidence interval，CI）。排除标准：①综述、评论、信件；②不同研究但入组患者相同。

1.3 文献筛选和质量评估

两位研究者根据纳入和排除标准完成文献筛选。Meta分析参考流行病学中观察性研究的Meta分析指南（Meta-analysis of observational studies in epidemiology，MOOSE）。纳入研究的质量评估包括以下6点：①描述入组患者的人种和国家；②具有清晰的研究设计；③具有完整的生存分析；④描述lncRNA的检测方法；⑤报道lncRNA的cut-off值。未满足上述条件的文献将被剔除。

1.4 数据提取

两位研究者进行数据提取工作。提取的数据包括作者姓名、国家、lncRNA名称、患者人种、病例数、病理类型、样本类型、lncRNA检测方法、HR值及95%CI、P值。

1.5 统计学方法

采用Stata 15.0软件对数据进行统计分析。采用Cochran’sQ检验和HigginsI2检验分析异质性。基于合并效应量的异质性，选择固定效应模型或随机效应模型。当异质性明显（I2＞50%或P＜0.05）时采用随机效应模型，反之则采用固定效应模型。HR值及95%CI用于分析lncRNA表达情况与食管癌患者预后的关系。合并的HR值大于1表示高表达的lncRNA与较差的预后有关。

2 结果

2.1 文献筛选结果

根据上述检索策略，共检出1217篇文献。删除重复文献后剩余606篇文献。

通过浏览标题、摘要和全文，最终筛选出25篇满足纳入、排除标准和质量评估的文献用于后续的系统评价[7-31]。此外，5篇文献用于荟萃分析[7-9,12,18]。（图1）

2.2 lncRNA表达情况与食管癌患者预后的关系

图1 文献筛选流程

纳入的文献共包含3830例食管癌患者，报道了22个与食管癌患者预后相关的lncRNA。其中在食管癌中高表达的为 HOTAIR[7-9]、SPRY4-IT1[11]、MALAT1[12,18]、NEAT1[13]、PCAT-1[14]、ZEB1-AS1[15]、uc002yug.2[16]、 CCAT2[17]、 TUG1[19]、 BANCR[20]、BC200[21]、AFAP1-AS1[22]、ATB[23]、FOXD2-AS1[24]、LINC01296[25]、XIST[26]和 NORAD[27]，低 表 达 的 为LOC285194[10]、LINC00675[28]、LINC01133[29]、MEG3[30]和GAS5[31]。在研究文献中，实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）用于检测lncRNA的表达水平。大部分文献中，研究者在食管癌与癌旁组织中均检测了lncRNA的表达，1篇文献中，研究者检测了食管癌组织、癌旁组织和血浆中的lncRNA的表达。根据总生存期的HR值及95%CI，食管癌患者中过表达的HOTAIR、SPRY4-IT1、MALAT1、NEAT1、PCAT-1、ZEB1-AS1、uc002yug.2、CCAT2、TUG1、BANCR、BC200、 AFAP1-AS1、 ATB、FOXD2-AS1、LINC01296、XIST和 NORAD预示着较差的生存期。然而，低表达的LOC285194、LINC00675、LINC01133、MEG3和 GAS5预示着较差的生存期。（表 1）

2.3 HOTAIR、MALAT 1表达情况与食管癌患者预后的关系

在纳入的文献中，共有5篇文献多次报道了食管癌患者中HOTAIR、MALAT1的表达情况及患者预后。其中3篇文献报道了食管癌患者中HOTAIR的表达情况及患者的生存情况，Cochran’sQ和HigginsI2异质性检验结果显示，各个研究间无明显异质性（I2=0%，P=0.606）。采用固定效应模型进行荟萃分析，结果显示，HOTAIR高表达与食管癌患者较短的生存期有关（HR=2.404，95%CI：1.661～3.479，P＜0.01）（图 2）。2篇文献报道了食管癌患者中MALAT1的表达情况及患者的生存情况，异质性检验结果显示，2个研究间存在异质性（I2=84.1%，P=0.012）。采用随机效应模型进行荟萃分析，结果表明，MALAT1表达水平与食管癌患者的预后无明显相关性（HR=3.384，95%CI：0.948～12.082，P=0.060）（图3）。由于荟萃分析的文献数少于10篇，因此无法评估发表偏倚。

表1 食管癌患者lncRNA表达情况及预后的回顾性研究

3 讨论

图2 HOTAIR表达与食管癌患者总生存期的森林图

图3 MALAT 1表达与食管癌患者总生存期的森林图

近年来，越来越多的研究证实了lncRNA参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移等过程，并在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色[32]。先前的研究已经报道了一些lncRNA可能与食管癌的预后具有相关性。但由于样本量小等局限性，这些研究的结论可能存在争议。因此，本研究采用系统评价和荟萃分析的方法，评估lncRNA表达情况与食管癌患者预后的相关性。通过检索和筛选共纳入25篇原始文献，包含3830例患者。通过系统评价发现，食管癌患者中高表达的HOTAIR、SPRY4-IT1、MALAT1、NEAT1、PCAT-1、ZEB1-AS1、uc002yug.2、 CCAT2、 TUG1、 BANCR、BC200、AFAP1-AS1、ATB、FOXD2-AS1、LINC01296、XIST和NORAD预示着较差的生存期，低表达的LOC285194、LINC00675、LINC01133、MEG3和GAS5预示着较差的生存期。

虽然经系统评价发现了多个与食管癌预后相关的 lncRNA，但仅有两个 lncRNA（HOTAIR 和MALAT1）及其生存数据可以用于荟萃分析。荟萃分析结果显示，HOTAIR高表达与食管癌患者较短的生存期有关（HR=2.404，95%CI：1.661～3.479，P＜0.01）。值得注意的是，尽管Huang等[18]研究显示MALAT1的表达与食管癌患者预后有关（HR=6.638，95%CI：2.948～14.497，P＜0.01），但荟萃分析结果表明MALAT1的表达水平与食管癌患者的预后无明显相关性（HR=3.384，95%CI：0.948～12.082，P=0.060）。

HOTAIR可能作为一种促癌基因在多种肿瘤的发生发展中发挥作用[33]。研究表明，在多种肿瘤中高表达的HOTAIR预示着较差的生存期（HR=2.00，95%CI：1.77～2.27，P＜0.01）[34]，与本研究结果一致。此外，HOTAIR在细胞水平和分子水平上的功能可能解释了HOTAIR与食管癌预后的相关性。研究表明，HOTAIR可以促进食管癌细胞的侵袭和转移，并通过启动子甲基化下调WNT抑制因子 1（WNT inhibitory factor 1，WIF1）的表达，从而活化 WNT/β-联蛋白（β-catenin）信号通路[8]。另一项研究发现，敲除小鼠模型的HOTAIR基因可以抑制食管癌细胞的增殖[35]。

尽管本研究制订了严格的检索策略及纳入和排除标准，但仍存在一些局限性：①由于缺乏相关的研究数据，仅有5篇原始文献中的生存数据可以进行荟萃分析，这可能降低了研究结果的统计学效力；②纳入文献中lncRNA的表达水平的界定存在差异，这可能增加了lncRNA的检测难度；③所有的入组病例均为亚洲人群，且食管癌病理类型均为鳞状细胞癌。但目前亚洲，尤其是中国为世界食管癌的高发区域，且绝大多数为食管鳞状细胞癌，这一不足似乎无法避免。

综上所述，系统评价和荟萃分析表明，多种lncRNA与食管癌患者的预后具有相关性，因此lncRNA可能成为食管癌患者潜在的预后生物标志物，这一结论也需要更多的数据来证明。