真核起始因子3b在乳腺癌中的表达及与患者临床特征的关系△

李延辉，方茅，谢敏如，夏明汗

1东莞市石碣医院病理科，广东 东莞523290

2广州医学院病理教研室，广州510000

3暨南大学附属第一医院病理科，广州510000

乳腺癌的发生发展是一个复杂、多因素参与的过程，基因表达调控异常在乳腺癌的发生发展中发挥关键作用。既往临床对肿瘤细胞增殖相关基因的调控主要集中在转录水平，事实上，翻译过程的异常调控也与肿瘤的发生密切相关。研究显示，在包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤中，参与真核生物蛋白质合成的真核起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF）的各种亚基表达水平发生了明显变化，其与恶性肿瘤的增殖、转移及患者的预后密切相关[1-2]。由于 eIF3b结构的特殊性，在eIF3复合物中起脚手架的作用，目前，大量研究提示，eIF3b通过调控蛋白翻译的过程参与细胞周期、细胞凋亡、侵袭和迁移等相关信号通路，影响肿瘤的发生发展[3-4]。但目前尚无以eIF3b为切入点揭示调控乳腺癌增殖、凋亡、侵袭和迁移的相关信号通路的研究。本研究检测了乳腺癌组织中eIF3bmRNA和eIF3b蛋白的表达情况，分析其与乳腺癌患者临床特征的关系，进而探讨eIF3b在乳腺癌发生发展中的作用和相关机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年11月至2018年11月东莞市石碣医院和暨南大学附属一院收治的乳腺癌患者。纳入标准：病理学诊断确诊为浸润性乳腺癌，接受根治性手术治疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤；术前接受放、化疗或内分泌治疗等抗肿瘤治疗；临床资料不完整。依据纳入和排除标准，本研究共纳入45例女性乳腺癌患者，年龄31～72岁，平均年龄为（54.6±8.5）岁。取45例乳腺癌患者手术切除的乳腺癌组织和相应的癌旁组织，癌旁组织取自距乳腺癌边缘约2 cm的组织，均经病理检查诊断为正常乳腺组织。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂和仪器 互补DNA（complementary DNA，cDNA）逆转录试剂盒、逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒均购自美国Invitrogen公司，兔抗人eIF3b多克隆抗体购自美国Abeam公司，二步法检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，eIF3b、β-actin引物均由中国上海博尚生物有限公司合成。

1.2.2 实时定量RT-PCR法检测eIF 3 bmRNA的相对表达量 取乳腺癌组织及相应癌旁组织标本，按照操作说明提取总RNA，加入100 μl裂解液研磨成匀浆状，置入1.5 ml离心管中12 000 r/min，离心 15 min，以 Trizol法抽提总 RNA。以 1 μg 的RNA为模板，按照RT-PCR逆转试剂盒操作说明书进行逆转录反应。以β-actin为内参，扩增条件：94℃ 5 min，94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 30s共45个循环。采用实时定量PCR法计算eIF3bmiRNA的相对表达量。eIF3b上游引物：5'-CGGTGCCTTAGCGTTTGTG-3'，下游引物：5'-CGGTCCTTGTTGTTCTTCTGC-3'；β-actin上游引物：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物：5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。

1.2.3 免疫组化法检测eIF 3 b蛋白的阳性表达率 严格按照免疫组化二步法试剂盒操作说明书进行，组织常规切片，脱腊水化，采用3%的过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，抗原修复，封闭。滴加一抗（稀释浓度为1∶1000），4℃孵育过夜，冲洗后滴加二抗（稀释浓度为1∶2000），37℃孵育，冲洗后二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染，脱水透明，封片。以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作为阴性对照。结果判定[5]：eIF3b蛋白主要定位于细胞质，细胞质呈棕褐色颗粒为阳性表达。按染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分。按阳性细胞所占百分比评分：＜5%为0分，5%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分。根据两项评分的乘积判断阳性结果，≥6分判断为阳性，＜6分则为阴性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对所-有数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验，两组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 eIF 3 b mRNA相对表达量的比较

乳腺癌组织中eIF3bmRNA的相对表达量为（2.85±0.22），明显高于癌旁组织的（1.02±0.23），差异有统计学意义（t=53.634，P＜0.01）。

2.2 eIF 3 b蛋白阳性表达率的比较

乳腺癌组织中eIF3b蛋白的阳性表达率为75.56%（34/45），明显高于癌旁组织的17.78%（8/45），差异有统计学意义（χ2=30.179，P＜0.01）。

2.3 不同临床特征乳腺癌患者乳腺癌组织中eIF 3 b mRNA相对表达量和eIF 3 b蛋白阳性表达率的比较

不同年龄、病理类型、肿瘤直径、组织学分级乳腺癌患者乳腺癌组织中eIF3bmRNA相对表达量的比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同腋窝淋巴结转移情况、TNM分期乳腺癌患者乳腺癌组织中eIF3bmRNA相对表达量的比较，差异均有统计学意义（t=4.921、3.360，P＜0.05）。不同年龄、病理类型、肿瘤直径、组织学分级乳腺癌患者乳腺癌组织中eIF3b蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同腋窝淋巴结转移情况、TNM分期乳腺癌患者乳腺癌组织中eIF3b蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=7.228、8.427，P＜0.05）。（表1）

3 讨论

eIF3是由a～m共13个亚基组成的多亚基真核细胞起始因子eIf，也是最大最复杂的起始因子，分子量为550～700 kD。eIF3参与了真核翻译起始进程中大多数的反应。eIF3可以调控不同类型mRNA的翻译起始过程，从而选择性地调控蛋白的合成，最终调控细胞的生长[6]。研究显示，eIF3可调控肿瘤的发生发展过程并影响细胞周期，如a、b、e和k亚基均可能参与细胞周期调控[7-8]。多项研究显示，在肿瘤细胞的增殖和恶性转化中，翻译过程可能出现调控异常，但肿瘤的发生发展与翻译调控失常之间的机制目前尚未研究清楚[9-11]。因此，直接参与这些生物学行为的关键因子，如eIF4E、eIF4G和eIF3亚基等将成为新的抗肿瘤治疗的潜在靶点，成为研究热点。其中eIF3的亚基eIF3b参与了蛋白翻译和细胞周期的调控及肿瘤的发生发展过程。2012年，Liang等[12]发现，eIF3b在胶质瘤组织和细胞中高表达；Wang等[13]下调结肠癌细胞株中eIF3b的表达，结果发现，细胞的生长被有效抑制，细胞周期发生停滞。2013年，Wang等[14]将敲除eIF3b的膀胱癌细胞注射到裸鼠皮下，观察细胞成瘤及肺转移的效果，结果显示，eIF3b可提供高肿瘤细胞的克隆形成能力，促进细胞转移；该研究者同时提出，eIF3b可能通过整合素/黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路参与调控膀胱癌的发生与黏附过程。

表1 不同临床特征乳腺癌患者乳腺癌组织中eIF 3 b mRNA的相对表达量和eIF 3 b蛋白阳性表达情况（n=45）

本研究为探讨eIF3的亚基eIF3b在乳腺癌组织中的表达及在乳腺癌发生发展中的作用，检测了乳腺癌组织及相应癌旁组织中eIF3bmRNA和eIF3b蛋白的表达情况，结果发现，45例乳腺癌组织中eIF3bmRNA的相对表达量和eIF3b蛋白的阳性表达率均明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01），表明eIF3b在乳腺癌发生的过程中可能发挥着重要作用，提示eIF3b可能成为一种新的乳腺癌诊断标志物。此外，乳腺癌组织中eIF3bmRNA的相对表达量和eIF3b蛋白的阳性表达率与乳腺癌患者临床特征的关系发现，eIF3bmRNA和eIF3b蛋白在乳腺癌组织中的表达可能与腋窝淋巴结转移和TNM分期有关（P＜0.05），表明eIF3b不仅可能参与了乳腺癌发生过程，也可能在乳腺癌的增殖、转移和侵袭过程中发挥促进作用，被认为可作为乳腺癌新的治疗靶点。这可能是因为eIF3b是直接参与蛋白合成的关键因子，其异常表达可能参与了调控乳腺癌的增殖和转移的过程，深入研究其调控作用机制，可能提供更直接、更有效的分子靶点治疗新策略，是下一步研究的方向。

综上所述，eIF3b表达增高不仅可能参与了乳腺癌发生过程，也可能在乳腺癌的增殖、转移和侵袭过程中发挥促进作用。