汉族人群中男性勃起功能障碍与色氨酸羟化酶2基因多态性的关系

2020-07-13张贤生

安徽医科大学学报 2020年6期

付旭，张贤生

勃起功能障碍(erectile dysfunction ,ED)定义为持续或经常无法达到和/或维持阴茎勃起足以使性满意，包括令人满意的性行为的阴茎勃起，被认为是血管、神经源性、结构性、激素性、精神性疾病或由药物、创伤引起的疾病，损害了患者的社会心理健康和生活质量。近期有研究[1]提示中国ED发病率为41.6%，性焦虑影响9%～25%的男性，并导致早泄和心因性ED[2]。色氨酸羟化酶2基因(tryptophan hydroxylase 2 ,TPH2)基因是中枢 5-HT 合成中的限速酶，其浓度及活性影响5-HT 的合成，TPH2 基因多态性影响其表达水平，进而调控中枢 5-HT 水平[3]。目前TPH2基因的研究主要集中于精神疾病领域，被认为在包括抑郁症在内的许多精神疾病中起着重要作用，但还没有关于TPH2基因多态性对ED影响的研究。该研究探究了该基因的3′UTR、5′UTR、编码区和交界区的多态性与ED的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料从安徽医科大学第一附属医院泌尿外科招募59例确诊为ED的男性，年龄22～58 (30.59±5.49)岁；另从健康检查中心招募151例健康对照者，年龄21～48(30.52±6.38)岁，采集他们的外周血样本，并抽提基因组DNA保存备用。入选标准如下：在21岁以上的年龄中，与同一个女性伴侣保持稳定关系，并尝试至少6次，国际勃起功能指数(international index of erectile function-5 ,IIEF-5)≤21。排除标准如下：脊柱损伤或神经系统疾病史，生殖器外伤史或阴茎畸形；合并其他性功能障碍；性伴侣存在性功能障碍。提供参与研究的书面知情同意书。本研究经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 TPH2基因测序及统计分析

1.2.1TPH2基因测序测序区域包括TPH2基因的完整编码区和调控区。调控基因组区域包括5′非翻译区(5′UTR)、3′非翻译区(3′UTR)和15 bp外显子-内含子交界区。利用primer 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)软件设计TPH2基因靶区的特异性引物，用ABI 2720热循环仪(ABI2720，美国应用生物系统公司)进行扩增反应。所有PCR产物均由上海天昊生物科技公司采用Illumina HiSeq测序仪(Hiseq，美国亿明达公司)2×150双端测序模式进行高通量测序分析。

1.2.2生物信息学及统计分析使用FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/FastQC/)对测序数据的质量进行评估，使用Burrows-Wheeler校准工具v0.7.15-r1140(http://bio bwa.sourceforge.net/)将序列比对到人类基因组参考序列(UCSC hg19)，生成BAM校准文件。使用Picard v2.2.1软件删除重复序列(https://broadinstitute.github.io/picard/)，只有测序深度大于10X的碱基才能进行后续分析，使用GATK软件(https://software.broadinstitute.org/GATK/)和VarScan v2.3.9软件(http://VarScan.sourceforge.net/)对每个样本进行基因变异检测，使用ANNOVAR软件包(http://ANNOVAR.openbioinformiscs.org/en/latest/)对单核苷酸变异(single nucleotide variants,SNV)进行功能注释，利用PolyPhen-2、SIFT和MutationTaster软件进行非同义和剪接位点变体的生物功能预测分析。连续变量和分类变量分别用SPSS(22.0版)进行t检验和非参数Krukcal-Wallis检验。常见单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism, SNP)位点(MAF>0.05)采用Plink软件(http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/)进行Hardy-Weinberg平衡(HWE)检验及病例对照间的基因频率差异分析，利用logistic回归分析计算优势比(OR)和95%CI，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料分析样本详细的人口统计学特征见表1。IIEF-5评分在ED组与对照组之间差异有统计学意义(P<0.001)。早泄诊断工具(premature ejaculation diagnostic tool ,PEDT)评分是评价射精功能的主观指标，ED组PEDT与对照组无明显差异(P=0.088)。年龄、体质指数以及教育程度均无明显差异。

2.2 TPH2基因多态性统计分析210个DNA样本成功进行了基因测序，共得到6个最小等位基因频率MAF>0.05的SNP位点数据，SNP位点详细信息见表2。在校正了年龄、婚姻状况、身体质量指数和教育程度后，rs11178998、rs7305115、SNV019、rs17110747位点的基因型分布及等位基因频率在ED组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 对照组与ED组临床资料分析

rs1007023是位于内含子-外显子交界区多态性，G等位基因频率在ED患者中高于对照组，差异有统计学意义(P=0.023)，见表3。ED组和对照组在不同遗传模型下分析，显示rs1007023在显性模型下，G/G+T/G等位基因型分布在ED组与对照组之间差异有统计学意义(P=0.028)，提示rs1007023的G/G+T/G等位基因患ED可能性较大，见表4。

3 讨论

Kulikova et al[4]通过使动物暴露在压力下来产生抑郁大鼠模型，抑郁大鼠大脑TPH2的表达明显低于健康大鼠，应激可抑制TPH2在脑组织中的表达，降低5-HT的浓度，其机制可能与TPH2基因启动子的甲基化增加有关。Wigner et al[5]研究表明TPH2基因-1449C>A位点与抑郁症的发生有关，C等位基因降低抑郁障碍发展的风险，支持了该通路参与抑郁症发病机制的假说。除此之外，ED严重程度与25(OH)D呈正相关[6]，低水平的维生素D可能通过促进内皮功能障碍而增加ED的风险，患有ED的男性应该进行维生素D水平的分析，对于低维生素的ED患者，建议补充维生素D[7]。维生素D激活大脑中一个VDRE处的TPH2的转录，诱导大脑TPH2的表达，从而选择性地增强中枢血清素[8]。如前所述，多种精神心理疾病影响甚至导致ED的发生，而TPH2被认为包括抑郁症在内的许多精神疾病中起着重要作用，因此TPH2可能与男性勃起功能相关，而本实验结果证实了ED与TPH2多态性相关，显示TPH2的SNP rs1007023中G等位基因可能为勃起功能障碍的危险性因素。rs1007023位点位于TPH2基因8号内含子，在RegulomeDB (http://regulomedb.org)数据库中查询，rs1007023位点的RegulomeDB score为5，这个评分说明rs1007023可能与转录调控关系不大。因此课题组又在HaploReg v4.1数据库(http://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php)中查询rs1007023位点在亚洲人群中的连锁位点的调控功能数据，发现有33个SNP位点与rs1007023的连锁r2>0.8，其中有3个位点(rs1843809、rs10748187、rs6582081)为保守位点，其中rs1843809在RegulomeDB数据库的评分是3a，并且位于HOXC-8转录因子的motif内，具有很强的调控证据，有2个位点(rs10784942、rs4760749)是转录因子结合位点，rs4760749位点同时与DHS、Enhance区域重叠，这2个位点在RegulomeDB数据库的评分分别是4，4，可能结合GATA3、ERALPHA_A、P300等转录因子，从而调控TPH2基因的转录表达，有5个SNP位点有调控转录因子结合motif改变的提示数据，有14个位点包括rs1007023位点均有eQTL的证据，综上所述rs1007023及其连锁位点可能参与调控TPH2基因的表达，从而与ED的发生有所关联，但rs1007023对勃起功能障碍的确切影响有待进一步研究，当然本研究也存在一些局限性，如研究样本量较小，其次中国ED患者超过50岁的男性由于尴尬甚至觉得年龄大ED是正常现象，可能较少到本院门诊就诊，因此应该考虑潜在的抽样偏倚，需要进一步扩大样本量的研究，如多中心招募更多的ED患者，以确认和扩展研究结果。