长链非编码RNA PVT1通过miR-17-5p调控肝癌细胞增殖与迁移的机制研究

崔士猛，杜 渐，罗海峰，闻庆平，苗 壮，温 超，吴 越

研究表明[1-2]长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)在多种癌症类型的基因组改变、诊断、预后和治疗预测中发挥着关键作用。到目前为止，lncRNA在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中已被证实在肿瘤细胞生长、化疗敏感性、药物诱导的细胞凋亡、肿瘤干细胞调控、治疗结果预测和病毒性肝炎相关进展中发挥重要作用[3-5]。因此，lncRNA作为HCC发病机制的调控因子，被认为是潜在的癌症治疗靶点。

TCGA数据库表明PVT1在HCC组织中表达明显上调。课题组的细胞水平研究显示，PVT1促进了HCC细胞增殖与迁移；通过生物信息学软件预测提示PVT1存在与miR-17-5p靶向结合的位点；而miR-17-5p在HCC中常呈低表达并影响其发生发展。现通过实验证明PVT1与miR-17-5p之间存在特异性调控关系，进而影响HCC细胞的增殖和迁移能力，为PVT1调控HCC细胞的分子机制奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料细胞株HepG2和Huh7购自上海中乔新舟公司；DMEM、胎牛血清及胰酶均购自美国Gibco公司。培养基通过DMEM添加10%胎牛血清进行配置，4 ℃保存不超过1周。细胞培养于37 ℃、5% CO2的培养箱中，每1～2 d换液1次，待细胞生长融合度达到80%～90%对细胞进行传代。

RIPA裂解液、BCA试剂盒、TRIzol提取试剂均购自北京碧云天公司；cDNA逆转录试剂盒及SYBR Green RealTime PCR MasterMix购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂盒及Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司；lncPVT1及siPVT1由上海吉玛公司构建；miR-17-5p模拟物、抑制剂及阴性对照寡核苷酸由上海吉玛基因设计及合成；双荧光素报告基因试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1细胞转染 转染前对细胞进行观测，待细胞融合度达到50%～70%时对细胞进行si-PVT1及miRNA的转染，NC为空载体，作为阴性对照。使用Lipofectamine 3000染试剂进行转染实验，根据说明书步骤将细胞放入培养箱37 ℃、5% CO2的环境培养6 h左右，随后对细胞进行换液。提取RNA在转染后24 h，蛋白提取在转染后48～72 h。si-PVT1由吉玛基因设计并构建：F:5-ATAGGATCCCGATGCTGGG-3, R:5-ATACGCTCGAGTCCGGAG-3。

1.2.2PCR定量 使用TRIzol对处理后的细胞进行总RNA提取，随后加入氯仿进行12 000 r/min 离心20 min，获取上清液，并加入异丙醇-20 ℃过夜，第2天进行12 000 r/min离心20 min，随后使用75%乙醇进行清洗。NanoDrop检测RNA的浓度及纯度。随后进行逆转录合成cDNA。PVT1-F:5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，PVT1-R:5′-AGAGCACCAAGACTGGCTCT -3′；miR-17-5p-F:5′-CGGCGGCAAAGTGCTTACAG-3′，miR-17-5p-R:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；GAPDH-F: 5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，GAPDH-R: 5′- ATGGCATGGACTGTGGTCAT -3′。

1.2.3双荧光素酶实验 将野生型Wt-PVT1和突变型Mut-PVT1序列插入到pGL4.74载体中，构建Luc-PVT1-WT和Luc-PVT1-MUT。所有的细胞24孔板过夜后，进行Luc-PVT1-WT/Luc-PVT1-MUT与miR-17-5p共转染，共转染时间12～24 h。采用双荧光素酶报道系统检测荧光素酶活性。

1.2.4CCK-8实验 以2×103/孔的细胞量将细胞接种于96孔板中，设置3个复孔，置于恒温培养箱中培养24 h，24 h后使用CCK-8试剂盒，按照说明书，每孔加入10 μl CCK-8溶液，培养箱孵育2 h，然后使用酶标仪检测波长在450 nm处的吸光度 (optical density，OD) 值，计算细胞增殖/抑制率。细胞增殖/抑制率(%)=(对照组OD值-敲降组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%

1.2.5划痕实验 每株细胞待生长至约90%融合时，用移液枪头进行划痕，使用力度均匀，宽窄一致，分别对细胞进行0、24 h的观测并记录。

1.3 统计学处理采用SPSS 16.0统计软件(SPSS, Inc.，Chicago, IL, USA)进行统计分析。采用独立t检验分析两组间的差异。组间数据比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA PVT1在HCC中呈高表达为了探究PVT1在HCC组织中的表达情况，首先通过TCGA数据库-生信网站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)对PVT1在HCC中的表达进行评估，见图1A。结果显示在HCC中PVT1的表达明显增高(P<0.05)。为探究PVT1在HCC细胞中的表达情况，使用L02细胞系作为对照，对Huh7、HepG2、Hep3B和Bel-7402细胞进行PVT1的检测，见图1B，结果显示PVT1在后3者中表达增高(P<0.05)。

2.2 lncRNA PVT1促进肝癌细胞增殖和迁移选取Hep3B和Bel-7402细胞系进行功能评价实验。首先通过转染技术构建PVT1低表达细胞系，进行转染效率的检测。结果证实si-PVT1能够显著降低细胞中PVT1表达，见图2A。与阴性对照组(si-NC)比较，CCK-8显示PVT1敲低后细胞增殖能力显著下降。见图2B。并且敲低PVT1抑制了肝癌细胞迁移能力，见图2C、D(P<0.05)。

2.3 PVT1能够与miR-17-5p靶向结合通过生信网站STARBASE和miRcode对PVT1进行miRNA靶点预测，见图3A。结果显示miR-17-5p存在与PVT1靶向结合的位点(mimic-NC为阴性对照组，mimic-17-5p为实验组)。为了证实预测位点的存在，使用荧光酶实验在2种细胞系中进行验证，见图3B。结果提示Wt组miR-17-5p能够与PVT1结合(P<0.05)。分析HCC细胞系中miR-17-5p的表达，结果显示miR-17-5p在HCC细胞中表达明显下降，见图3C。另一方面，通过TCGA数据库对PVT1与miR-17-5p的表达进行了相关性分析，见图3D。结果表明PVT1与miR-17-5p表达呈现负相关(P<0.01)。以上实验证明了PVT1能与miR-17-5p结合且二者表达呈负相关。

2.4 PVT1通过miR-17-5p影响肝癌细胞增殖和迁移能力为了验证PVT1是通过miR-17-5p靶向结合从而影响HCC细胞的生物学功能。对敲低PVT1的细胞系进行miR-17-5p的检测，见图4A。结果提示敲低PVT1后导致miR-17-5p表达升高(P<0.05)。通过共转染实验验证miR-17-5p抑制了PVT1对HCC细胞增殖的影响，见图4B。划痕实验证明miR-17-5p抑制了PVT1诱导的HCC细胞迁移，见图4C。上述结果表明PVT1对HCC细胞增殖和迁移能力的影响机制是通过miR-17-5p发挥作用。

图1 lncRNA PVT1在肝癌组织和细胞中高表达

图2 长链非编码RNA PVT1影响肝癌细胞增殖和迁移

A：PVT1的转染效率；B：细胞的生存能力；C：敲低PVT1后Hep3B细胞的迁移能力；D：敲低PVT1后Bel-7402细胞的迁移能力；与si-NC比较:**P<0.05，*P<0.05

图3 PVT1与miR-17-5p靶向结合

A：Targetscan 预测结合位点；B：Hep3B细胞系相对荧光素酶活性；C：Bel-7402细胞系相对荧光素酶活性；D: miR-17-5p相对表达量；E：PVT1与miR-17-5p表达的相关性(Spearmen-correction：0.4993，p-value：6.547e-24，Sample：n=357)；与PVT1Wt mimic-NC比较：*P<0.05; 与PVT1Mut mimic-NC比较：#P<0.05；与L02比较：△P<0.05

图4 PVT1通过miR-17-5p促进HCC细胞增殖和迁移

A：miR-17-5p转染效率； B：CCK - 8测定细胞生存能力；C：细胞迁移能力的测定；a：inhibitor-NC；b：siPVT1+inhibitor-NC；c：inhibitor；d：inhibitor+siPVT1；与mimic-NC比较：**P<0.01；与inhibitor-NC组比较：#P<0.05；与inhibitor组比较：△P<0.05

3 讨论

研究[6-7]发现PVT1能够参与肿瘤细胞多种生物学功能，包括影响细胞增殖、侵袭和迁移、代谢等过程。本实验探究了PVT1对HCC细胞增殖及迁移能力的影响。近年来，不断有研究证实ceRNA是lncRNA发挥调控肿瘤细胞功能的具有重要意义的调控机制。lncRNA可通过靶向结合某些miRNA，并间接的抑制miRNA对其靶基因的调控作用，从而实现了对肿瘤发生、发展的影响。有研究[8]发现，PVT1能够作为辅助肿瘤诊断或判断患者预后的标志物。本研究通过TCGA数据库分析了PVT1在HCC组织中的表达情况，并在细胞系中证实了PVT1在肝癌细胞中的高表达趋势。

miRNAs被认为是各种肿瘤的独立调控因子，在ceRNA机制上也发挥着特定的作用。一般认为miRNA是lncRNA调控肿瘤发生的靶基因，通过与lncRNAs相互作用或靶向mRNA参与许多人类肿瘤的生物学过程。miR-17-5p参与肝癌的多种生物学效应且能在很大程度上提高癌细胞生长[7]。除了miR-17-5p外，其他miRNA例如miR-181a-5p也与癌细胞的生命活动息息相关[9]。lncRNA PVT1能否作为ceRNA参与对miR-17-5p表达的调控需要进一步验证。

本研究证实 PVT1能够与miR-17-5p靶向结合，并通过共转染实验验证了lncRNA PVT1对肝癌细胞的影响是通过抑制miR-17-5p从而发挥作用。为了探寻PVT1在肝癌细胞中的潜在分子机制，通过荧光素酶实验证实了数据库的预测结果。实验结果表明PVT1可以与miR-17-5p靶向结合。进一步实验显示PVT1通过阻断miR-17-5p的表达，正向调控肝癌细胞增殖和能力。但其靶基因和下游的目标蛋白都是哪些分子，这些问题有待进一步研究。