铁皮石斛多糖对RANKL诱导的小鼠骨髓单核细胞向破骨细胞分化影响的体外研究

李汉青，王 芳，何家才

探索能有效抑制过度破骨细胞形成和功能的药物对于预防和治疗炎症引起的种植体周围骨吸收至关重要[1-2]。核因子κB受体活化因子配体 (receptor activator of nuclear factor-κ B ligand，RANKL)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)超家族的成员，来源包括巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞和 T 细胞[3]。RANKL可以通过与破骨前体细胞表面的RANK特异性的结合，激活下游信号通路，诱导调节破骨细胞形成。石斛为兰科石斛属多种植物的新鲜或干燥茎的统称。在石斛属植物中，铁皮石斛被认为具有最佳的中药药用特性，特别是富含多糖的茎和叶，近来的一些研究[4]表明石斛多糖具有抗癌、抗感染、免疫增强等生物活性。该研究旨在探讨铁皮石斛多糖对 RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化的影响，以期为种植体周围骨吸收的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器MEMα培养基(美国赛默飞公司)；PBS缓冲剂(美国Solarbio公司)； BI胎牛血清(以色列生物工业公司)；RIPA 裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制剂(上海碧云天生物技术有限公司)；重组小鼠RANKL(美国R&D公司)；重组小鼠M-CSF(美国R&D公司)；蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；CCK-8试剂(日本同仁化学研究所)；PCR引物逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；c-Fos鼠单克隆抗体(武汉谷歌生物科技有限公司)； p65兔单克隆抗体(美国ABCAM公司)；NFATc1兔单克隆抗体、phospho-p65(p-p65)兔单克隆抗体、P38兔单克隆抗体、phospho-p38(p-p38)兔单克隆抗体(美国CST公司)；Actin鼠单克隆抗体(北京中杉金桥公司)；山羊抗鼠/兔二抗(北京中杉金桥公司)；牛血清白蛋白(BSA)(德国BioFROXX公司)；恒温CO2培养箱(美国赛默飞公司)；全自动酶标仪(美国Bio-Red公司)；荧光倒置显微镜(德国Leica公司)；实时荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司)。

1.2 方法

1.2.1BMMs体外分离培养 选取4周龄的SPF级C57BL/6雄性小鼠，使用脱颈法处死， 75%乙醇溶液中消毒，剥除小鼠腿部的皮肤，自股骨头处将腿部分离，去除肌肉骨骺，保留股骨、胫骨，PBS清洗2遍，注射器吸取含10%FBS的MEMα培养基冲洗骨髓腔冲出骨髓，过70 μm细胞筛，加4倍于骨髓悬液体积的红细胞裂解液，混匀，作用3 min，1 500 r/min 离心5 min，弃上清液，用MEMα完全培养基重悬，培养24 h，次日收集上清液中未贴壁细胞，用含50 ng/ml 巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)的MEMα完全培养基培养，每3 d换液，直至细胞达到目标数量。

1.2.2铁皮石斛多糖制备 铁皮石斛原球茎60 ℃烘干，粉碎，90 ℃水浴，震荡，室温静置30 min， 2 000 r/min离心10 min，收取上清液，加质量体积分数3%三氯乙酸脱蛋白，4 ℃静置24 h，4 000 r/min 离心15 min，收上清液，加入无水乙醇配制成75%乙醇溶液，4 ℃静置12 h，4 000 r/min离心15 min，弃上清液，收集沉淀物，冻干处理，称重，去离子水充分溶解制成石斛粗多糖溶液，过滤除菌，-80 ℃保存。

1.2.3CCK-8法检测BMMs增殖能力与细胞活力 收获BMMs，在96孔板中以1 000/孔的密度铺板，每组设置5复孔，待过夜细胞贴壁稳定后，对照组添加含有50 ng/ml M-CSF的MEMα完全培养基，实验组石斛多糖浓度分别为25、50、100、200、400 μg/ml，在37 ℃、5% CO2的条件下培养，分别在12、24、48、72 h进行CCK-8检测，吸去上清液，每孔加入100 μl含有10 μl CCK-8试剂的纯MEMα培养基，吹去气泡，37 ℃孵育2 h，通过酶标仪测定450 nm处的吸光度(optical density,OD)值。

1.2.4Western blot检测 ① 状态良好的BMMs，在6孔板中以1×105个细胞/孔的密度铺板，阴性对照组添加含有50 ng/ml M-CSF及10% FBS的MEMα培养基，实验组在此基础上添加100 ng/ml RANKL以及不同浓度的石斛多糖(0、25、50、100、200 μg/ml)，3 d换液，第5天提取总蛋白。② 在6孔板中以3×105个细胞/孔的密度铺板，待细胞过夜稳定，阴性对照组添加含有50 ng/ml M-CSF及MEMα完全培养基，实验组用浓度分别为0、25、50、100、200 μg/ml铁皮石斛多糖预处理2 h，加入100 ng/ml的浓度RANKL，刺激30 min，提取蛋白。使用Brandford法进行蛋白定量，配制SDS-PAGE凝胶，6%和10%分离胶，5%浓缩胶，电泳后将蛋白转至0.45 μm PVDF膜上，5% BSA封闭45 min，一抗稀释液稀释抗体，抗p65(1 ∶800)、抗phospho-p65(1 ∶500)、抗c-Fos(1 ∶500)、抗p38(1 ∶1 000)、抗phospho-p38(1 ∶500)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤膜，以1 ∶5 000浓度室温孵育二抗1 h，曝光显影。通过Image J进行灰度分析。

1.2.5qRT-PCR检测 在6孔板中以1×105个细胞/孔的密度铺板，实验分组设置阴性对照组添加含有50 ng/ml M-CSF及10% FBS的MEMα培养基，实验组在对照组的基础上添加100 ng/ml RANKL以及不同浓度的石斛多糖，浓度分别为0、25、50、100、200 μg/ml，于1、3、5 d收细胞提取RNA，检测活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1, NFATc1)、组织蛋白K(cathepsin K,CTSK)、金属基质蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRACP)基因的表达。相关引物序列见表1，引物由上海生工设计合成。

1.2.6TRACP染色 收获BMMs，在24孔板中以1×104/孔的密度铺板，每组设置4复孔，待过夜细胞贴壁稳定后，实验分组如下：阴性对照组添加含有50 ng/ml M-CSF及10% FBS的MEMα培养基，实验组在对照组的基础上添加100 ng/ml RANKL以及不同浓度的石斛多糖，浓度分别为0、25、200 μg/ml，每3 d全换液，在第7天吸去上清液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，TRACP染色试剂盒实验步骤进行染色，倒置显微镜拍照。

表1 相关基因引物序列

2 结果

2.1 石斛多糖对BMMs细胞增殖活力的影响CCK-8实验显示：25～200 μg/ml浓度范围内，细胞增殖活力与对照组(0 μg/ml)相比差异无统计学意义(P>0.05)，在24、48、72 h，400 μg/ml组细胞增殖受到抑制，OD值显著低于对照组，差异有统计学意义(F=202.664，F=103.908，F=38.942，P<0.05)。见图1。

2.2 Western blot检测铁皮石斛多糖对RANKL诱导的BMMs向破骨细胞分化相关蛋白表达的影响通过不同浓度的石斛多糖作用于RANKL诱导的破骨细胞分化，检测破骨细胞活化中的核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路和p38通路的相关蛋白，NFATc1，转录因子c-Fos(transcription factor c-Fos,c-Fos)，p38、p-p38、p65、p-p65，以Actin作为内参，结果显示铁皮石斛多糖抑制了c-Fos，NFATc1蛋白的表达(F=106.011，F=119.529，P<0.05)，降低了了p65和p38的磷酸化水平(F=896.024，F=843.935，P<0.05)，而对于p65和p38总蛋白含量无明显影响(F=8.125,F=0.668,P>0.05)。见图2。

2.3 石斛多糖对RANKL诱导的BMMs破骨分化相关基因表达的影响不同浓度的石斛多糖处理BMMs 1、3、5 d后，在RANKL诱导的条件下，通过qRT-PCR法检测破骨细胞相关基因的表达。qRT-PCR的检测结果显示：1、3、5 d，CTSK的表达持续上调(F=104.894，F=122.260，F=780.135，P<0.05)；1、3、5 d，50、100、200 μg/ml组NFATc1的表达表现出上升趋势(F=36.736，F=283.965，F=124.576，P<0.05)；TRACP前期表达水平较低，随着时间其表达量明显上升(F=399.484，F=5 110.477，F=1 398.642，P<0.05)；MMP9基因表达总体表现出上升(F=284.939，F=114.198，F=255.071，P<0.05)，100 μg/ml及200 μg/ml组MMP9的表达量在5 d时出现下降(F=194.290，F=559.875，P<0.05)；同时间段，石斛多糖组相关基因表达始终低于0 μg/ml即单纯RANKL诱导组，且表现出剂量依赖(P<0.05)，第5天时，0 μg/ml组相对于200 μg/ml组CTSK的表达为：537.23±17.08(F=780.135，P<0.05)，NFATc1的表达为10.11±1.46(F=124.576，P<0.05)，MMP9的表达为911.93±42.45(F=255.071，P<0.05)，TRACP的表达为471.69±6.71(F=13.98.642，P<0.05)。见图3。

图1 CCK-8法检测石斛多糖对BMMs细胞增殖活力的影响

图2 Western blot检测破骨细胞蛋白水平的表达

A：Western blot法检测c-Fos、NFATc1、p-p65、p65、p-p38、p38蛋白的表达；B：Western blot灰度统计分析；1：对照组；2：0 μg/ml组；3：25 μg/ml组；4：50 μg/ml组；5：100 μg/ml组；6：200 μg/ml组；与0 μg/ml组比较：*P<0.05

图3 qRT-PCR检测破骨分化相关基因表达

2.4 破骨细胞TRACP染色结果显示：单纯RANKL诱导有体积相对较大，包含有超过10个细胞核的破骨细胞形成，高浓度铁皮石斛多糖组的破骨细胞形成明显受到抑制，仅形成了少量体积相对较小的不成熟破骨细胞。见图4。

图4 破骨细胞TRACP染色 ×100

A: 对照组；B: RANKL+0 μg/ml石斛多糖；C：RANKL+25 μg/ml石斛多糖；D：RANKL+200 μg/ml石斛多糖

3 讨论

本研究观察到石斛多糖在体外抑制RANKL诱导的破骨细胞形成，表明其在治疗种植体周围炎骨吸收的潜力。鉴于先前证实的石斛多糖的免疫调节活性[5-6]和抗癌活性[7]，石斛多糖可能也是治疗伴随肿瘤的骨破坏性疾病的候选药物。 故如能揭示石斛多糖对于破骨细胞作用的分子和细胞机制，对于探索其骨溶解的治疗潜力将是非常有价值的。

骨再生和重塑中受控的量的吸收是正常骨生理学的一部分。骨形成与再吸收的平衡是不稳定的，诸如慢性炎症或癌症中的骨转移等病理情况下，破骨细胞生成因子与破骨细胞抑制因子的比例上调导致骨的净吸收发生。破骨细胞分化由间充质细胞通过细胞间接触和旁分泌作用所支持，其受M-CSF和RANK，RANKL和骨保护素(osteoprotegerin, OPG)信号通路轴的调控。M-CSF和RANKL对于破骨细胞形成是必需的，M-CSF主要通过上调Bcl-xL来刺激破骨细胞祖细胞的存活和增殖，而RANKL刺激破骨细胞的分化[8]。本实验中使用原代培养的C57BL/6小鼠的骨髓单核细胞，通过M-CSF和RANKL进行诱导，相较于使用巨噬细胞系诱导破骨细胞更符合体内破骨细胞的来源。RANK属于TNF超家族受体，最初在T淋巴细胞和成骨细胞中被鉴定，RANKL与RANK的结合导致受体的三聚化并募集衔接蛋白肿瘤坏死受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)募集。随后启动细胞内信号的级联，包括NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、活化蛋白-1(activator protein 1，AP-1)、NFATc1。在这些信号传导途径中，具有共刺激免疫受体的RANKL / RANK / TRAF6轴导致转录因子c-Fos和NFATc1的强烈诱导，其在破骨细胞分化中起着不可或缺的作用。c-Fos是AP-1转录因子复合物的组成部分，参与破骨细胞形成的调节。NFATc1作为破骨细胞分化中的主要转录因子，在RANKL介导的NF-κB、AP-1和MAPK信号传导途径的下游发挥作用[9]。c-Fos信号的传导可以触发NFATc1的自动扩增，这是NFATc1依赖性转录过程和RANKL诱导的破骨细胞生成所必需的，NFATc1的活化会上调下游破骨细胞特异性基因的表达，例如CTSK、TRACP、MMP9等[10]。本研究中，石斛多糖显示出显著下调了c-Fos的蛋白质水平。且降低NFATc1的基因转录和蛋白表达水平，随后以剂量依赖性的方式降低破骨细胞标记基因CTSK和TRACP的基因表达水平，MMP9为破骨细胞重要的功能酶，本实验显示铁皮石斛多糖同时下调了MMP9的基因表达水平，表明其铁皮石斛多糖可能同时会抑制破骨细胞吸收功能。RANKL / RANK也激活NF-κB途径，NF-κB为调节破骨细胞分化重要的转录因子。 IκB的降解使得NF-κB复合物(包括NF-κBp65/ Rel A)磷酸化易位至细胞核并启动靶基因的转录[11]。本实验显示石斛多糖抑制NF-κB活性，其抑制了p65的磷酸化，而对于总p65含量无明显影响，故可能影响p65的核迁移，从而降低了后续相关基因的表达。p38 MAPK途径在RANKL介导的破骨细胞分化中起重要作用[12]。本实验检测了铁皮石斛多糖对于P38通路的作用，发现石斛多糖减弱了p38的磷酸化，而对于总p38蛋白含量无明显作用。此外，细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)[13]、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)[14]等也对于破骨细胞的形成，存活，功能有着重要作用。 对于这些信号通路分子，石斛多糖是否发挥作用，从而影响破骨细胞的形成，存活和功能，需要后续实验进一步研究探索。