斑马鱼Ngly1的生物学特性及克隆表达研究

李平,武慧志,熊秋宏,王牛牛,肖涵,赵仲华,吴长新

(1.山西大学 生物医学研究院,山西 太原 030006;2.长治医学院 中心实验室,山西 长治 046000)

0 引言

代谢是由一系列将营养物转化为代谢物,从而为细胞存活和增殖提供能量的生化反应途径所组成。细胞代谢不仅包含小分子的降解,而且还包含蛋白质、聚糖及脂质的生物合成和分解代谢。内质网(ER)是负责蛋白质生物合成最重要的细胞器之一,具有有效的质量控制系统,可以区分异常和正常蛋白质[1-3]。这种系统被称为内质网相关降解途径(ERAD),其中蛋白酶体在蛋白质降解途径中起重要作用。

糖基化是蛋白质和脂质的关键翻译后修饰之一,包含两种主要类型:O-糖基化和N-糖基化。O-糖基化是在粗糙的内质网或顺式高尔基体中进行,而N-糖基化是内质网中一种共翻译或翻译后修饰方式,通过位于内质网和高尔基体的多个糖苷酶和糖基转移酶进行连续修饰[4-5]。 此外,糖基化在内质网质量控制机制中发挥重要作用,确保错误折叠的蛋白质不会被运输到高尔基体,N-聚糖酶在此过程中起最重要作用。

Ngly1(酵母/小鼠中的PNG1/Ngly1)是一种可以在内质网相关降解途径中将N-聚糖从错误折叠的糖蛋白上裂解,并在错误折叠的糖蛋白的降解中起重要作用并且高度保守的N-聚糖酶[6-9]。Ngly1可以催化N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNac)最内层与N-糖蛋白上Asn残基之间的酰胺键水解,从而产生脱N-糖基化蛋白,其中N-糖基化的Asn残基被转化为Asp和1-氨基 GlcNac结合的游离寡糖[9]。

Suzuki等在芽殖酵母中首次鉴定出了ngly1基因,后来在多种物种中均发现了Ngly1同源蛋白,包括酿酒酵母[6],盘状线虫[10],秀丽隐杆线虫[11],裂殖酵母[12],Medaka鱼[13],果蝇[14], 小鼠[15-16]和拟南芥[17]等。截至到目前,ngly1基因在斑马鱼中的作用尚未报道。研究表明,缺乏Ngly1的C57BL/6小鼠具有胚胎致死性,所以在成年动物中研究分析Ngly1的功能比较困难。鉴于斑马鱼(Daniorerio)是在发育生物学和遗传学分析中研究人类疾病强有优势的模式生物,因此探究斑马鱼ngly1基因的功能对于解析人类疾病(如先天性去糖基化障碍等[18])的病理原因具有重要意义。本研究利用生物信息学及分子生物学方法鉴定和表征斑马鱼ngly1基因的功能。

1 材料与方法

1.1 实验动物

野生型斑马鱼在明暗周期为14 h和10 h,温度为28℃的条件下进行喂养,每天喂食两次。胚胎通过自然杂交获得,受精卵在28.5℃下孵育,并根据Kimmel[19]等方法进行分期。所有实验均根据当地实验动物保护伦理委员会批准的指南进行。

1.2 分子克隆,序列分析和质粒构建

在斑马鱼基因组数据库(http:∥www.ensembl.org/Danio-rerio/blastview)中找到斑马鱼ngly1基因的编码序列,并利用PCR从斑马鱼胚胎cDNA中扩增目的片段,构建pCS2-ngly1表达载体:上游引物,5′-ATGCCTGGCTCTCAAGGAGTC-3′;下游引物, 5′-AGACTTTTCCATCTCAACCATCACT-3′,通过测序确定(中国上海生工有限公司)构建成功。

1.3 RT-PCR和qRT-PCR

1.4 细胞培养

HEK293T细胞培养在含有体积分数10%胎牛血清,体积分数1%青霉素和链霉素的DMEM培养基中,置于含体积分数5% CO2的培养箱,37℃培养。使用PEI(Polyscience,Cat.No 23966-2)将质粒DNA进行细胞转染,转染后的细胞孵育培养24～48 h。

1. 5 生物信息学分析

斑马鱼基因ngly1cDNA的核苷酸序列和氨基酸序列从Ensembl数据库(http:∥asia.ensembl.org/index.html)中下载获得。通过ExPaSy(http:∥www.expasy.org/tools/)获得蛋白质特征,并通过SMART数据库(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)对蛋白质结构域进行拓扑分析。经过BLAST分析获得24个物种的ngly1基因序列,对这些相似序列进行多重比对,然后使用MEGA7.0软件[20]构建最大似然树(图2)。鼠PNGase(Ngly1)的晶体结构作为参考模型[21-23],用Swiss-Model(http:∥swiss model.expasy.org)对斑马鱼Ngly1蛋白进行同源建模。

表1 内参基因和引物序列

2 结果

2.1 生物信息学分析

斑马鱼ngly1基因全长为16 kb,由11个外显子组成(图1A),cDNA全长为2 844 bp,包括207 bp的5′非翻译区(UTR),1 935 bp的开放阅读框(ORF)和702 bp的3′非翻译区(UTR),能够编码含645个氨基酸的蛋白质。通过预测可知,Ngly1的分子量和理论等电点(pI)分别为72.44 kDa和6.00,且在斑马鱼ngly1基因中预测出两个潜在的磷酸化位点,一个泛素化位点和一个乙酰化位点。

为了分析斑马鱼Ngly1蛋白在进化中的保守性,我们使用Mega 7.0软件对人、小鼠和斑马鱼Ngly1氨基酸序列进行多序列比对。结果表明人、小鼠和斑马鱼中的所有NGLY1/Ngly1蛋白均由三个同源结构域组成,即 PUG,TGc和PAW,这些结构域均高度保守(图1B)。

为了预测斑马鱼Ngly1的三级结构,选择包含PUB结构域(2hpj.1.A)的N末端[22],包含TGc(2f4m-A)的核心结构域[21]和包含PAW的C末端(2g9g.1.A)[23]的小鼠Ngly1作为模板进行斑马鱼Ngly1的三级结构同源性建模。结果表明,斑马鱼Ngly1的N末端区域(aa 3-99)主要由左手反平行的四个α螺旋组成,两个α螺旋中间含有1个包含两个短的α螺旋和一个β链的连结,扭曲的反平行片由3个β链形成(图1C)。斑马鱼Ngly1的核心区域(aa 154-438)包含转谷氨酰胺酶样折叠和锌结合域(图1D)。转谷氨酰胺酶样结构域具有位于中央且强烈弯曲的六链反平行β折叠,这个β折叠被凹入侧的8个α-螺旋和凸出侧的3个α-螺旋所围绕;锌结合域包含一个三链β-折叠,如图1D所示。斑马鱼Ngly1的C末端区域(aa 442-643)是1个稍微延长的分子,展现出一个β三明治结构,该结构包括两层,由17条β-反平行链和2个短α螺旋组成(图1E)。

使用MEGA 7.0构建系统发育树,推断鱼类ngly1与其他动物之间的进化关系(图2)。结果显示,斑马鱼ngly1的进化中是保守的,而且具有很高的支持度。通过系统发育树揭示的亲缘关系可知,斑马鱼ngly1基因是人类NGLY1和其他脊椎动物的直系同源基因(图2)。

2.2 斑马鱼ngly1的克隆与表达

根据蛋白质结构的预测,斑马鱼Ngly1包含3个结构域:PUG(aa 20-81),TGc(aa 286-341)和PAW(aa 477-569)(图1B)。根据斑马鱼基因组数据库的序列信息扩增得到斑马鱼ngly1,并通过Sanger测序确定pCS2-Ngly1-GFP表达质粒构建成功。为了进一步研究其蛋白表达,分别将pCS2-GFP和pCS2-Ngly1-GFP质粒转染到HEK293细胞中,观察到这些质粒具有相似的转染效率(图3A,B)。蛋白质印迹分析表明,单独转染了pCS2-GFP的HEK293T细胞在分子量约为27kD处有一条明显的GFP蛋白条带,如图3B所示,而在pCS2-Ngly1-GFP转染的细胞中,可观察到一条斑马鱼Ngly1蛋白融合GFP的条带,其分子量约为98 kD(图3B)。

2.3 ngly1的组织特异性表达

为了研究ngly1的组织分布,从健康斑马鱼的不同组织中提取总RNA,例如心脏、腮、肝脏、脾脏、肾脏、鳔、眼、脑、卵巢、睾丸、肌肉和肠等,并且通过qRT-PCR测定ngly1的转录水平,先前的研究提示我们应谨慎选择内参基因[24]。为了找到适合斑马鱼组织分布的内参基因,通过qRT-PCR在12种不同组织中验证了4个常用内参基因(β-actin,18S rRNA,Rpl13α和GAPDH)的表达。图4分析了从心脏、鳃、肝、脾、肾、游泳、眼、脑、卵巢、睾丸、肌肉和肠中分离到的总RNA。Rpl13α的表达可作为ngly1组织表达的内参。结果显示,与其他内参基因相比,Rpl13α以最低的±SD值在不同组织中表现出最相似的表达水平,然而,GAPDH在不同组织中以最大的±SD值表现出最大的差异(图4A)。因此,将Rpl13α的表达作为检测ngly1表达的内参基因。结果显示,ngly1在卵巢和睾丸中表达水平最高,其次是脑,腮,眼,肠,脾,肾,肌肉,心脏和鱼鳔。但肝脏中ngly1基因表达水平最低(如图4B)。

图1 不同物种Ngly1的生物信息学分析

2.4 胚胎发生过程中ngly1的时空表达

为了检测斑马鱼ngly1在不同胚胎发育阶段的mRNA表达,分别从2细胞期,24 h,36 h,48 h,72 h和5 d的鱼中提取总RNA,并进行qRT-PCR,同时还评价了候选参考基因(β-actin,18SrRNA,Rpl13α和GAPDH)在胚胎发育过程中的稳定性表达。结果显示,与其他内参基因相比,不同发育阶段的18S rRNA mRNA表达水平表现出最高的相似度和最低的±SD值。然而,在不同发育阶段,β-actin,Rpl13α和GAPDH的表达显示出相似的±SD值且远高于18S rRNA的表达(图5A)。因此,使用18S rRNA的表达作为ngly1时空表达的内参。结果显示,斑马鱼ngly1在包括2细胞期,24 h,48 h和72 h在内的所有发育阶段均普遍表达,但在5 d时表现出最高表达(图5B)。

3 讨论

本研究通过生物信息学分析鉴定了斑马鱼ngly1基因与哺乳动物的亲缘关系,克隆了斑马鱼ngly1基因,并且确定了其时空表达模式。通过同源建模及结构预测可知,Ngly1蛋白的654个氨基酸包含三个结构域:PUG(aa 20-81),TGc(aa 286-341)和PAW(aa 477-569),斑马鱼Ngly1蛋白与其他已知脊椎动物Ngly1具有高度相似的蛋白结构(图1)。

图2 ngly1核酸序列的系统进化树分析,数字表示支持度,比例尺表示进化距离

图3 重组Ngly1的表达

图4 ngly1的组织特异性表达

图5 胚胎发育过程中ngly1基因的时空表达

在内质网相关降解期间,多功能AAA ATPase p97是蛋白质降解复合物的一部分,p97与Ngly1的N末端PUG结构域相关联以募集哺乳动物中泛素化的底物[22]。Ngly1从错误折叠的糖蛋白中除去N-连接的寡糖,这是内质网相关降解途径的一部分,涉及Ngly1核心结构域与HR23蛋白紧密复合物的形成,而且该蛋白通过与泛素和26S蛋白酶体的组成成分相互作用而参与泛素蛋白酶体途径[25-26]。除了Ngly1的N末端和核心结构域外,C末端结构域还通过与N-连接的寡糖链的甘露糖部分结合以增强小鼠Ngly1核心结构域的活性，而在内质网相关降解途径中发挥重要作用[23]。根据与小鼠Ngly1的三级结构比对,斑马鱼Ngly1可能参与p97,HR23或N-连接寡糖链的甘露糖部分相同的相互作用,从而在内质网降解途径中起作用。此外,还进行了亲缘关系分析,以探索ngly1基因的进化历程,发现该基因在24种脊椎动物中进化上非常保守。

本文还克隆了全长ngly1基因,并通过荧光显微镜观察和蛋白质印迹分析对其进行了确认。通过GFP单克隆抗体在转染的HEK293T细胞裂解液中检测到分子量大小约为98 kD的蛋白,可证明是与GFP融合的Ngly1蛋白(图3A,B)。

绘制了斑马鱼ngly1的时空表达模式。为了研究ngly1的表达,使用Rpl13α作为内参,通过qRT-PCR检测来自斑马鱼的各种组织中ngly1的表达。在成年鱼中,与其他组织相比,ngly1基因主要在卵巢和睾丸中表达,这一结果与先前的研究一致,即ngly1在小鼠睾丸中表达最高的结果一致[16]。然而,ngly1在斑马鱼肝脏中的表达最低,这与已报道的Ngly1在小鼠肝脏的表达并不一致,猜测这可能是由于使用了不同的内参基因以及哺乳动物肝脏和斑马鱼肝脏的结构本身存在差异所导致。斑马鱼早期发育过程中,ngly1在胚胎发生过程中普遍表达,并且第五天达到最高水平，但在小鼠胚胎发生中,Ngly1的时空表达尚不清楚。

缺失Ngly1的C57BL/6小鼠可导致胚胎致死,而另一种脱N-糖基化酶可以挽救部分Ngly1缺陷小鼠的致死性[27]。此外,Ngly1的缺失也会导致小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中内质网相关降解过程的失调，但是通过额外敲除ENGase基因又可以减缓Ngly1-/-细胞的内质网相关降解途径的失调[28]。这表明细胞质ENGase可能是NGLY1缺乏症的潜在治疗靶标之一[27]。