重组人禽流感H7N9疫苗株在Vero细胞上的适应性和传代稳定性研究

崔兆海，赵卫忠，马 磊，高菁霞，朱文勇，李卫东，廖国阳

(中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所， 昆明 650018)

甲型H7N9禽流感是一种人畜共患病，且死亡率高[1]。2013年在中国首次报道流感病毒H7N9感染人，随后H7N9流感病毒共引起5波流感爆发[2-4]。据相关报道，截止2018年6月，一共有1 567人感染H7N9禽流感病毒，其中死亡615人[5]。2013年在中国发现的33例感染者中就有9人死亡[6]。流感病毒是RNA病毒，易出现变异，近年高致病的H7N9毒株的出现，可能会给人类带来更大的危害[7]。

目前，应对流感大爆发最有效的手段仍然是疫苗的接种[8，9]。而流感疫苗的生产除了对宿主有一定的要求外，对疫苗株的传代稳定性也有要求[10]。本文将H7N9 Vero细胞适应株(A/Anhui/1/2013Va)在Vero细胞上连续传代，并在病毒分子水平和细胞水平进行研究，以确定该毒株是否可以作为Vero细胞生产H7N9流感疫苗的种子，以期为开发细胞流感疫苗提供前期研究。

1 材料与方法

1.1 细胞及毒株

第145代Vero细胞购自美国ATCC;甲型流感病毒Vero细胞适应株A/Anhui/1/2013Va(H7N9)为本实验室构建及保存，毒株的构建在成都军区疾病控制中心P3实验室中完成;MDCK细胞(P18)购自中国科学院昆明动物所细胞库(KBC2006105YJ)，应用时代次为第30代。

1.2 主要试剂及仪器

DMEM/F12(Lot8119213)、MEM培养基均购自Gibco公司；TPCK胰酶(Lot39B19083)购自Worthington公司；牛血清白蛋白(Lot.No.913Z0517)购自北京索莱宝科技有限公司；RNA病毒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；H7N9抗原标准品(NIBRG-268)和H7抗血清标准品(Sheep SH644)均购自NIBSC。

1.3 病毒传代稳定性

Vero细胞按照1∶4传代，显微镜下观察细胞长成致密单层时，将病毒从-70 ℃取出，流水融化后按照病毒感染复数(multiplicity of infection，MOI)为0.01的病毒量接种H7N9 病毒，35 ℃吸附2 h后将吸附液弃掉，用PBS洗细胞面2次，再加病毒维持液10 mL继续置于35 ℃培养箱中培养72 h，72 h时细胞完全被病毒裂解，收取病毒液。病毒连续传代15次，每次试验做2次重复。

1.4 血凝试验

将新鲜的鸡血红细胞用生理盐水配成1%的体积浓度，在96孔板的U形板的A1～H12孔中各加入50 μL生理盐水，具体方法参照郭元吉等[11]。在血凝板的第一行(A1～H1)孔中依次加入待检测流感病毒样品50 μL，用8道移液器将第一列的生理盐水或样品吹打混匀后，取50 μL到第二列，更换枪尖，再按照同样的操作依次将样品进行倍比稀释，到最后一个稀释度时，弃掉50 μL液体。同时设立阴性对照孔，在各孔加入新鲜配置的1%鸡红细胞悬液50 μL，轻轻拍打U形板外壁，室温静置30 min后观察并记录结果。

1.5 各代病毒收获液TCID50的检测

MDCK细胞长成致密单层后，用0.125%的EDTA-胰酶消化后计数，按照每孔2×104个细胞的量接种到96孔板，于37 ℃、5%CO2培养箱培养约24 h。用病毒维持液将病毒从10- 4稀释到10- 9，每个稀释度接种8孔，每孔接种100 μL病毒，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养72 h，血凝试验检测病毒效价，Reed-Muench法[12]计算病毒的组织培养半数感染量(50%tissue culture infection dose，TCID50)。每块96孔板做1次重复。

1.6 病毒生长曲线

将第16代的病毒按照MOI为 0.01的病毒量接种于Vero细胞。在24、36、48、60、72 h分别取病毒上清，血凝试验检测不同时间段的病毒效价，试验重复3次。观察细胞接毒后不同时间段的病变状况。

1.7 单向免疫扩散试验

在琼脂糖凝胶中混入抗血清标准品，将其铺好并在上面打孔。孔中加入标准抗原和待检样品(第1和16代病毒)，室温进行免疫扩散。若待检样品和标准样品型别一致，则会形成抗原抗体复合物，考马斯亮蓝染色后形成肉眼可见的扩散环。

1.8 不同代次重配H7N9病毒的鸡胚半数感染量试验

将第1、5、16代的病毒用0.01 mol/L的PBS按照对数稀释法从10-1稀释至10-9，每个稀释度接种9日龄鸡胚4枚，每枚接种病毒液200 μL；35 ℃、65%湿度的孵箱培养3 d后取尿囊液进行血凝试验检测病毒的效价，计算病毒的鸡胚半数感染量(egg 50% infectious dose，EID50)。

1.9 测定H7N9重配病毒鸡胚半数致死量

将第1、5、16代的病毒用0.01 mol/L的PBS按照对数稀释法稀释，以107、106、105EID50分别接种9日龄鸡胚，每个稀释度接种鸡胚6枚，每枚接种0.2 mL，接种12 h时，检查鸡胚生长状态，弃掉死胚，继续培养72 h，统计鸡胚死亡数量。

1.10 重配毒株HA和NA基因稳定性的研究

为了检测病毒在Vero细胞上连续传代后血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)基因是否发生变异，我们将培养的第1代和第16代病毒的HA和NA基因分别克隆到pLB载体上，并将构建好的质粒送往生工测序。测序结果通过NCBI网站及DNA STAR软件分析，确定病毒的HA和NA基因在Vero细胞连续传代过程中是否发生变异。

2 结果与分析

2.1 病毒连续传代每代效价及感染性滴度

重配病毒从第2代在Vero细胞上连续传至第16代。每代病毒收获液的血凝效价变化如图1a所示：从图中可以看出，从第8代病毒开始，病毒在Vero细胞上的病毒效价基本趋于稳定，而且随着病毒代次的增高，病毒的效价稳定维持在384～448；病毒的感染性滴度从第2代开始均在1×106.75TCID50/mL以上，且随着病毒代次的增高，病毒感染性滴度维持在1×107TCID50/mL左右。

图1 各代病毒的效价及感染性滴度Fig.1 Viral titer and infectious titer of each generation of virus

2.2 病毒在Vero细胞的生长曲线

病毒接种Vero细胞后在不同时间段的产量不同，从图2a可以看出病毒在各个时间段病毒效价的差异。在24 h内取病毒维持液上清，血凝试验结果为阴性。随着培养时间的推移，病毒产量逐渐增高，直至细胞完全病变，病毒效价达到最高。显微镜下观察接种病毒后不同时间段的Vero细胞，如图2b所示的是病毒接种24 h的细胞，细胞的形态正常；到48 h时病毒的增殖使得部分细胞裂解，细胞形成网状结构(图2c)；72 h时细胞完全裂解，这时病毒效价达到最高，为448(图2d)。流感病毒为胞外毒，通过对细胞裂解状态的观察及病毒在不同时间段效价的高低可以确定具体的收毒时间。

2.3 单向免疫扩散结果

如图3所示：其中1和4是H7N9抗原标准品；2和5是第16代病毒；3和6是第1代病毒。重配病毒H7N9与NIBSC的标准抗H7N9抗血清反应后出现抗原抗体免疫复合物扩散环，虽然与标准H7N9抗原形成的环大小有差异，但是足以说明重配病毒H7N9血清型表型属于H7型。

图2 病毒生长曲线及病毒感染后不同时间段细胞状态Fig.2 Virus growth curve and cell status at different time periods after virus infection(a)病毒在Vero细胞的增长曲线；(b)接种病毒24 h时Vero细胞的状态；(c)病毒接种Vero细胞48 h时细胞状态；(d)病毒接种Vero细胞72 h时细胞状态(a)The growth curve of the virus in Vero cells;(b)The state of Vero cells at 24 hours after virus inoculation;(c)Cell status of Vero cells inoculated with virus at 48 h;(d)Cell status of Vero cells inoculated with virus at 72 h

图3 单向免疫扩散型别鉴定结果图Fig.3 Identification results of unidirectional immune diffusion type1和4：标准抗原；2和5：第16代病毒；3和6：第1代病毒1 and 4:Standard antigen;2 and 5:The 16th generation virus;3 and 6:The firse generation virus

2.4 病毒鸡胚半数感染量及致死量

第1、5、16代病毒在9日龄鸡胚半数感染量结果如表1所示。其中第1代病毒的EID50是106/0.2 mL，第5代病毒的EID50是106.25/0.2 mL，第16代病毒的EID50是106.25/0.2 mL。从以下结果可以看出病毒在传代的过程中，不同代次的病毒虽然鸡胚半数感染量存在差异，但是差异不显著。107、106、105EID50分别接种9日龄鸡胚孵育72 h，检蛋后并未发现死胚的存在, 说明病毒在传代过程中，其毒力并未发生改变。

表1 不同代次的病毒鸡胚半数感染量Tab.1 Half infection of viral chicken embryos in different generations

2.5 病毒连续传代的HA和NA基因稳定性

提取第1代和第16代H7N9病毒的基因，阳性克隆PCR结果如图4所示。HA和NA核苷酸大约在1 500 bp左右，挑选出阳性克隆菌落，通过测序结果分析发现,病毒在Vero细胞上连续传代过程中，第1代病毒中NA的核苷酸序列与第16代病毒的一致，并未出现基因位点的改变。序列对比如图4e所示，HA的核苷酸序列编码框内A12G发生了同义突变，但并未造成编码氨基酸的改变。从基因序列水平上验证病毒的型别并未发生改变，这进一步说明病毒在Vero细胞上传代后基因是相对稳定的。

图4 第1和第16代H7N9阳性克隆PCR鉴定及序列对比Fig.4 PCR identification and sequence comparison of P1 and P16 generation H7N9 positive clones(a)第1代病毒HA；(b)第16代病毒HA；(c)第1代病毒NA；(d)第16代病毒NA；(e)HA对比序列。红色圆内是同义突变位点(a)The HA gene of the first generation virus;(b)The HA gene of the 16th generation virus;(c)The NA gene of the first generation virus;(d)The NA gene of the 16th generation virus(e)HA alignment sequence. Synonymous mutation sites are inside the red circle

3 讨论

虽然流感病毒对鸡胚较敏感，但是鸡胚作为生产流感病毒的基质，不仅存在流感流行时鸡胚供不应求的问题，且在疫苗生产过程中，存在鸡胚易污染、病毒在鸡胚中增殖时HA基因易变异等问题[13]。以MDCK细胞作为基质生产的流感疫苗虽然已有产品上市，但是MDCK致瘤性问题一直存在争议。现有多项研究表明Vero细胞可以作为流感疫苗的生产基质[14-16]。

流感病毒感染早期奥司他韦等药物可控制病情，奥司他韦主要通过抑制流感病毒的神经氨酸酶进而抑制病毒的增殖。但是近年相关研究报道NA的R294K的突变使得NA阻断剂的效果降低[17]。基质蛋白2(matrix protein，M2)S31N的突变使得病毒对金刚烷胺不敏感[18]。耐药株的出现使得免疫保护策略显得尤为重要。目前H7N9禽流感疫苗的免疫效果及安全性研究仍处于临床试验阶段，未有成品上市[19，20]，这也意味着H7N9 Vero细胞适应疫苗株地开发仍有着重要意义。

本研究将重配病毒在Vero细胞上连续传15代，从第8代开始病毒的血凝效价趋于稳定，血凝效价维持在384～448。病毒的感染性滴度Log10TCID50/mL维持在7左右，均达药典要求。从第7代到第8代，病毒血凝效价有一个上升峰，可能是由于除HA和NA基因，病毒外内部6个基因中某些位点的改变使得病毒在Vero细胞上的适应性进一步增强，病毒产量从而升高的结果。通过对第1和16代的病毒基因测序分析发现，病毒在传代过程中型别均未发生改变，基因编码的HA和NA蛋白氨基酸序列也未发生改变。以上试验结果证明，该重配病毒不仅在Vero细胞上高产，其在传代过程中HA和NA抗原基因序列也是稳定的。通过病毒生长曲线的绘制及细胞接种病毒后不同时间段细胞病变的状况得知，最佳收毒时间为72 h左右。总之，本研究证明该H7N9毒株具备疫苗供体株生产疫苗的能力，为H7N9疫苗的开发及H7N9流感的防控奠定了物质及技术基础。