幽门螺杆菌CagA 基因和消化道疾病的关系研究

叶东雯

从目前临床情况来看,有＞50%的人群存在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染的情况,但是实际上只有一部分患者会发生消化道疾病,因此临床对于Hp 感染和消化道疾病之间的关系一直是临床研究的焦点［1］。其中Hp 感染致病的差异性是研究的重点,在很多研究中均可发现,几乎所有的Hp 菌株均存在尿素酶、粘附因子等多种毒力因素的影响,因此其并不能对Hp 感染出现不同临床结果的现象做出合理解释。近些年的研究中发现,在Hp 致病性中有一个因素起到了重要作用,即Hp 毒素,在一些学者的研究中指出［2］,在具有空泡毒素活性的Hp 营养液中可以查到一种相对分子量为128000 的蛋白质,虽然其并不直接介导毒素的活性,但是与空泡毒素的表达存在密切关系［3-6］,因此临床将其称为CagA,并且其只存在于具有空泡毒素活性的菌株中。因此,本研究选择163例消化道疾病患者作为研究对象,观察Hp 的CagA 基因与其之间的关系,为临床的预防和诊断提供科学依据,具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2017年4月～2018年12月就诊于本院的163例消化道疾病患者作为本次研究对象,其中男81例,女82例；年龄23～65 岁,平均年龄(44.2±7.3)岁。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离和鉴定 将选取的胃黏膜标本进行无菌研磨处理,将其接种在Karmali 血平板上,在37℃、微需氧条件下培养5 d 后观察结果。选出合格菌落对其实施革兰染色镜检,并进行快速尿素酶实验、触酶试验、氧化酶试验以及尿素酶基因检测。将使用上述方法进行确定的Hp 菌株使用布氏肉汤加入小牛血清(10%)进行增菌培养,培养5 d 后将菌液加入20%的甘油,混和后将其迅速放置于-80℃环境中进行冻存。

1.2.2 模板DNA 的制备 取少许Hp 菌落置于200 μl冻存液中制成Hp 混悬液,取1 μl Hp 混悬液加入裂解液200 μl(含有蛋白酶K,浓度200 mg/L),经55℃水浴10 min,煮沸10 min 后,以1×104r/min 离心5 min,取上清液5 μl用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增。

1.2.3 PCR 扩增CagA 基因PCR引物针对CagA基因保守区设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：D008 5-ATAATGCTAAATTAGACAACTTCAGCGA-3(nt 1751-1778),R0085-TTAGAATAATCAACAAACATCACGCCAT-3(nt 2021-2048),扩增靶位片断长度为297 bp,PCR 反应液体积20 μl,内含有1 μmol D008/R008引物,2.0 U Taq DNA聚合梅,0.4 mmol dNTP,2.0 mmol MgCl2。反应条件：94℃变性5 min,35 个循环(94℃变性5 min,55℃退火1 min,72℃延伸1.5 min),终止延伸72℃ 5 min。PCR 产物经18 g/L 琼脂糖凝胶电泳,0.5 μg/L 溴化乙锭染色,于紫外光灯下显影。以菌株NCTC11637CagA 阳性作阳性对照,去离子水作空白对照。

1.3 统计学方法 采用SPSS25.0 统计学软件进行统计分析。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 病理结果 163例消化道疾病患者的胃黏膜标本中分离出Hp 菌株43 株,阳性率为26.38%。其中消化性溃疡18 株(包括十二指肠溃疡和胃溃疡),浅表性胃炎6 株,萎缩性胃炎4 株,胃癌15 株。

2.2 CagA 基因在消化道疾病中的分布 43 株Hp 菌株中,CagA 基因阳性率为81.40%(35/43),CagA 基因在消化性溃疡中的阳性率为83.33%(15/18),在浅表性胃炎中的阳性率为50.00%(3/6),在萎缩性胃炎中的阳性率为75.00%(3/4),在胃癌中的阳性率为93.33%(14/15)。胃癌的CagA 基因阳性率高于浅表性胃炎,差异具有统计学意义(χ2=5.2191,P=0.0223＜0.05)；消化性溃疡、萎缩性胃炎与浅表性胃炎的CagA 基因阳性率比较,差异无统计学意义(χ2=2.6667、0.6250,P=0.1025、0.4292＞0.05)。见表1。

2.3 CagA 基因与肠上皮化生以及慢性胃炎急性活动程度之间的关系 163例消化道疾病患者中有慢性胃炎患者52例。Hp CagA 阳性慢性胃炎患者的中、重度急性活动性胃炎发生率为76.67%,高于CagA 阴性慢性胃炎患者的31.82%,差异具有统计学意义(P＜0.05)；Hp CagA 阳性慢性胃炎患者的肠上皮化生发生率为53.33%,与CagA 阴性慢性胃炎患者的36.36%比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表1 CagA 基因在消化道疾病中的分布情况(株,%)

表2 CagA 基因与肠上皮化生以及慢性胃炎急性活动程度之间的关系(n,%)

3 讨论

在本次研究中可以发现,163例消化道疾病患者的胃黏膜标本中,分离出了Hp 菌株43 株,43 株Hp 菌株中,CagA 基因阳性率为81.40%(35/43),此结果提示,在43例患者感染Hp 菌株中有81.40%含有CagA 基因,这与相关研究［7-9］结果一致。结果还显示,CagA 基因在消化性溃疡中的阳性率为83.33%(15/18),在浅表性胃炎中的阳性率为50.00%(3/6),在萎缩性胃炎中的阳性率为75.00%(3/4),在胃癌中的阳性率为93.33%(14/15)。胃癌的CagA 基因阳性率高于浅表性胃炎,差异具有统计学意义(χ2=5.2191,P=0.0223＜0.05)；消化性溃疡、萎缩性胃炎与浅表性胃炎的CagA 基因阳性率比较,差异无统计学意义(χ2=2.6667、0.6250,P=0.1025、0.4292＞0.05)。此结果提示,CagA 阳性基因与胃癌的发生有密切关系,当CagA 基因阳性率达到90%以上时需要警惕胃癌的发生,同时通过CagA 阳性率还可以对消化性溃疡、萎缩性胃炎以及浅表性胃炎进行判断,尤其是对于无明显临床症状的患者［10-14］。在本次研究中,作者选取了52例慢性胃炎进行了研究,经过研究发现CagA 阳性Hp 感染者的炎性活动程度与CagA 阴性Hp感染者相比明显较高,这可能与具有CagA 阳性Hp 菌株可产生空泡毒素诱导宿主产生白细胞介素-8 和白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α,促进中性粒细胞活化等有关。在肠上皮化生发生率方面Hp CagA 阳性感染患者与CagA 阴性感染患者之间的差异并不大,此结果提示,CagA 和肠上皮化生的发生关系不大。

综上所述,Hp 的毒力因子CagA 与消化道疾病的发生有着密切的关系,以胃癌最为明显,且在Hp CagA阳性感染中发生中、重度急性活动性胃炎的几率较高,临床可通过对CagA 基因阳性率来判断疾病发生的可能性,对相关疾病的发生采取积极预防措施。