经唑来膦酸处理的羟基磷灰石对兔胫骨骨缺损的治疗效果

张志鹏 孙海滨 黄丽丽 刘军华 秦凯强 薛志刚 张宏涛

（1.昌乐县人民医院，山东潍坊 262400；2.潍坊市中医院，山东潍坊 261041）

骨折的愈合是指骨折断端间的组织修复过程，最终恢复骨骼的正常结构与功能。然而，尽管骨科器械不断地发展，骨折缺损仍是困扰骨科大夫的一大难题，骨折不愈合的现象仍然存在。尤其是骨折断端存在明显缺损，不得不通过植入自体骨或者人工骨来填充。迄今为止，自体骨移植都被认为是治疗骨缺损的金标准，然自身骨髂取骨区存在诸多并发症。外源性生物因子rhBMP_2的生物活性效果理想，价格昂贵，在临床上大量推广是不现实的。

唑来膦酸是含双氮双膦酸类药物，具有非常强的抗骨吸收的能力，可以不同程度抑制破骨细胞的活性，或者减少破骨细胞的数量，最终做到减少骨的丢失，相关研究表明低浓度唑来膦酸长时间局部应用于骨折断端可明显促进骨折愈合的速度[1]，但唑来膦酸对人工骨应用于粉碎性骨缺损区的作用鲜有报道。本实验探讨唑来膦酸与人工骨结合对骨缺损区愈合的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

25只6～8月龄雄性新西兰大白兔（清洁级，合格证号：SCXK（鲁）2016 0002）体质量 3～ 4 kg，平均体质量（3.5±0.33） kg，将所有兔左后腿标记为实验组，所有兔的右后腿标记为对照组。实验动物经潍坊医学院动物伦理委员会同意，主要实验药物唑来膦酸注射液为中国正大天晴公司生产，批号为国药准字20041246。

1.2 实验模型的制备

实验动物麻醉完成后，将固定好的左后肢取中段，应用骨刀及咬骨钳取大小约1 cm×2 cm的骨骼，造成骨缺损区，然后将预先配置好的10-9mol/L的唑来膦酸液浸泡羟基磷灰石人工骨，浸泡10 min后植入骨缺损区，经浸泡过的明胶海绵置入骨缺损区表面，应用可吸收线捆绑，包扎后应用高分子石膏制成夹板固定。术后给予肌注庆大霉素1支，预防感染。同法处理新西兰大白兔的右腿，区别于实验组的是应用生理盐水浸泡羟基磷灰石及明胶海绵。

1.3 观察指标及检测方法

（1）影像学指标：术后第10周应用大型X线机观察实验组及对照组骨缺损区的愈合情况。

（2）组织学观察：分别在术后第4、6周麻醉处死1只兔子，实验兔左右两侧骨缺损区取人工骨与自身骨骼交界处的骨组织，切片，并进行HE染色，并应用高倍显微镜观察，比较2者的差异。

HE 染色步骤：

①取石蜡切片依次放置于二甲苯和浓度梯度乙醇中脱蜡并水化。

②移至苏木素染色 5 min，流水去苏木素液 3 s。

③1%盐酸乙醇 3 min，流水 3 s。

④0.5%伊红溶液3min，流水促细胞核返蓝30min。

⑤浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明后中性树脂盖玻片封片。

⑥应用显微镜观察。

（3）骨密度情况：分别取术后第2、4、6周骨折缺损区人工骨与自身骨骼交界处的骨组织，并进行骨密度测定，比较2者的差异。

1.4 统计学分析

应用SPSS 23.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨折缺损模型的制备

在实验操作中有1只新西兰大白兔因麻醉过量致死，及时给予补充，1只在第3周时因感染死亡。其余新西兰大白兔均在预定的设想下进行，无明显特殊情况发生。

2.2 影像学检查结果

图1 实验组10周情况

图2 对照组10周情况

通过影像学检查可明显看出实验组较对照组骨密度明显增加，骨小梁更为密集，排列更规则，骨缺损区成高密度表现，而对照组则骨质明显疏松，骨缺损区密度较实验组明显减低。

2.3 HE染色结果

在第4、6周实验组骨小梁均较对照组明显增多。

根据HE染色结果可明显看出在术后第6周对照组的骨小梁较纤细，且数量较少，散在分布，周围成骨细胞数量较少；然而实验组有大量新生骨小梁，粗壮且数量较多，并且可观察到大量的成骨细胞，少量的炎性细胞。术后10周，对照组骨小梁数目较6周时明显增多，且明显粗壮、密集，但新生骨量较实验组少，成骨细胞数量较多；实验组骨折区新生骨小梁数目较术后6周时明显增多，规则排列，与骨长轴平行排列，新生骨内可见同心圆状哈弗氏系统，成骨细胞、软骨细胞散在分布于骨小梁周围，数目明显较6周时减少。

2.4 骨密度测定

第4、6周，实验组骨密度值明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），第2周则无明显统计学差异。

表1 骨密度测定（±s）

表1 骨密度测定（±s）

实验组 0.294 2±0.009 30.323 2±0.004 4 0.356 4±0.007 9对照组 0.286 7±0.010 30.309 5±0.007 6 0.328 1±0.010 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

唑来膦酸作为第三代含氮双膦酸盐类药物，具有强大的抗骨吸收作用，可抑制破骨细胞的活性或减少破骨细胞的数量，从而减少骨的丢失。在治疗骨质疏松方面的作用是肯定的，现在国内临床上已经大量应用于骨质疏松性压缩骨折经皮椎体成形术（PVP）术后，以及绝经后老年女性的抗骨质疏松治疗。其主要的药理作用是通过抑制破骨细胞的活性来有效地抑制骨吸收。许多学者发现了甲羟戊酸通路对破骨细胞的功能十分重要，并且证明了含氮双膦酸盐是通过抑制该通路发挥作用的[2-4]。张健等[5]发现，唑来膦酸能够抑制破骨细胞活性，而有关作用机制的研究主要集中在其作用途径上。目前认为，含氮双膦酸盐能够抑制骨吸收的分子生物学机制，主要是通过抑制甲羟戊酸途径，尤其是作用于法尼基焦磷酸合成酶，从而抑制破骨细胞功能，诱导细胞凋亡的。此外，有学者认为[6]，唑来膦酸除了直接作用于破骨细胞外，还可以间接通过作用于成骨细胞来调节破骨细胞活性，从而抑制骨吸收。有研究[7]表明在低浓度范围（≤10-9）mol/L时，唑来膦酸不影响成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性，而是促进骨钙素基因表达，使得矿化沉积增加，表明唑来膦酸在低浓度范围不影响成骨细胞的增殖，促进成骨细胞分化和矿化功能，一定程度上抑制了破骨细胞的活动，使骨吸收与骨形成达到平衡。

本研究得出，唑来膦酸的局部应用对骨折缺损区骨折的愈合确实有一定的作用。在第10周影像学检查可以看出，实验组骨密度较对照组骨密度明显增加，且骨组织排列更加紧密；从组织学染色可以看出，实验组较对照度骨小梁明显增多，且更加粗壮，成骨细胞数量增加时间更早，新鲜骨组织更多，骨折断端新鲜血管更加丰富。通过测定两组骨密度情况可明显看出实验组骨密度较对照组有所增加。而且低浓度的唑来膦酸不仅减少骨质流失，而且促进血管的形成，使骨折断端营养得到了保证，总而言之，经唑来膦酸浸泡的羟基磷灰石治疗骨折缺损的效果是肯定的。但是对于唑来膦酸是否与羟基磷灰石发生进一步反应还需进一步探究。

图3 高倍显微镜10×40结果