剑叶龙血树内生放线菌活性菌株的筛选和鉴定

田守征 黄之镨 赵玉瑛 赵庆 张晓梅

摘 要：  為筛选具有抗菌抗肿瘤活性的药用植物内生菌资源，该文对300余株分离自中国云南西双版纳及越南地区剑叶龙血树的内生放线菌采用琼脂块扩散法进行抗病原细菌活性筛选、平板对峙法进行抗真菌活性筛选、SRB法测定菌株的细胞毒活性及PCR扩增方法筛选非核糖体肽合成酶NRPS基因及聚酮合酶PKS-I、PKS-Ⅱ基因;对得到的优势菌株经8种培养基进行发酵，采用10种病原细菌、3种病原真菌及2种人肿瘤细胞株测试其发酵粗提物的抗菌及抗肿瘤活性以确定最佳发酵培养基;用16S rRNA基因测序方法初步鉴定5株优势菌株的分类地位。结果表明：初筛得到5株抗菌活性、体外细胞毒活性及NRPS、PKS相关基因表达阳性的菌株S01-S05，其中4株（S01-S04）属于链霉菌属、1株（S05）属于类诺卡氏菌属;菌株经不同培养基发酵后产物的抗菌和抗肿瘤活性不同，其中Streptomyces sp. S04在7种培养基中的发酵提取物对8种测试病原菌均有较强抑制作用，且该菌株用Medium C的发酵提取物对人肝癌 Hep G2 细胞株抑制率达到 100%，为剑叶龙血树内生菌活性成分挖掘及新型抗菌药物筛选奠定了基础。

关键词： 剑叶龙血树， 内生放线菌， 抗菌活性， 抗肿瘤活性， 16S rRNA基因分析

中图分类号：  Q939

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2020）05-0727-08

Bioactivity and identification of endophytic actinomycetes from Dracaena cochinchinensis

TIAN Shouzheng1， HUANG Zhipu2， ZHAO Yuying2，

ZHAO Qing2， ZHANG Xiaomei1*

（ 1. College of Basic Medicine， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China; 2. College of Traditional Chinese Medicine， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China）

Abstract：  In order to screen endophytic bacteria resources with antitumor activities from medicinal plant， 300 endophytic actinomycetes isolated from Dracaena cochinchinensis collected from Xishuangbanna， China and Vietnam were studied. SRB method was used to detect the activity of antitumor cells， agar diffusion and plate confrontation methods were used to test antimicrobial activities， Polymerase Chain Reaction was used to detect NRPS， PKS-I and PKS-Ⅱ genes， and the taxonomic studies of the five selected active strains were performed using 16S rRNA gene analysis. Eight media were designed to cultivate five selected active strains and the antimicrobial activities of their fermented extraction were detected by oxford-cup test against ten pathogenic bacteria and three pathogenic fungi， the antitumor activities were measured by MTT assay in two tumor cell lines. As a result， four of the five active strains were classified as Streptomyces spp. and the remaining one as Nocardioides sp. Different media resulted in different activities， most media of strain S04 showed strong activities against eight pathogens and the inhibition rate of the fermentation product of S04 in Medium C on Hep G2 cell line was up to 100%， which could be a novel resource for the mining of bioactive compounds for further studies.

Key words： Dracaena cochinchinensis， endophytic actinomycetes， antimicrobial activities， antitumor activities， 16S rRNA gene analysis

微生物来源的天然产物在人和动植物疾病中发挥着重要作用，广泛用作抗细菌、抗真菌和抗肿瘤的临床药物，在医药行业和农业方面做出了重要贡献（Katz & Baltz，2016）。已发现3万多种微生物来源的代谢产物中，约有30%由放线菌所产生，60%由真菌产生，10%由粘细菌产生（Bérdy，2012;Subramani & Aalbersberg，2012）。据保守估计，迄今为止从微生物中发现的次生代谢产物数量仅占其基因组所编码总数的20%～30%（Ikeda et al.，2003），且自然界中至少90%以上的微生物资源未被人们认识。现在普遍认为，新生境可能蕴藏新物种，新物种可能拥有新基因，新的基因资源可能决定了代谢机制的多样性和新颖性，从而能极大程度地避免化合物重复发现的问题（Tiwari & Gupta，2012）。近年来的统计发现，从特殊生境微生物中分离到新的活性物质的概率远高于普通土壤微生物，它们极有可能成为发现新活性先导化合物及新药的重要来源（Bull et al.，2005）。因此，人们把研究目光转向栖息于特殊生境的微生物，如海洋、动植物内生环境、高温热泉、盐湖、洞穴等各种极端环境（Zhang et al.，2013;张道锋，2013;张晓梅，2014）。

植物内生菌（endophytes）是指那些生活史的部分或全部阶段生活于健康植物组织内部的真菌或细菌，宿主植物不表现出病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生（朱文勇，2013）。内生菌是一类非常重要的微生物资源，它们具有独特的分化和发育过程，使其能够适应植物内部这个特殊的环境，同时它们还能够编码产生多种生物活性物质，被广泛应用于医药、工业、农业、食品以及环保等领域。内生菌和高等植物经长时间的协同进化，为适应宿主体内微环境，允许自身与宿主植物之间进行基因信息的交流转移，使得自身發生遗传变化，使某些内生菌产生抗生素、植物生长激素等生物活性物质，尤其是一些内生菌还获得了产生和宿主植物相同或相似化合物的能力，提示我们从植物内生菌尤其药用植物内生菌中挖掘具有宿主植物相似活性代谢产物的潜力极大。世界范围内对内生菌研究的关注始于1993年，Stierle从短叶紫杉的内生真菌中发现紫杉醇（Stierle et al.，1993），此后喜树碱、鬼臼毒素和长春新碱等抗癌明星药也陆续从其原产植物的内生真菌中发现（Amna，2006）。内生放线菌次生代谢产物的研究较内生真菌少，典型代表是云南美登木内生放线菌 Streptomyces spp.，从中分离得到一系列萘霉素类（naphthomycin K）、巴佛洛霉素类、Ⅲ型聚酮类、大环内酯等类型的新化合物（Lu & Shen，2007;Li et al.，2008;Yang et al.，2012），大部分具有抗菌或抗肿瘤细胞等活性。目前已得到的具有多种生物活性的聚酮类化合物和非核糖体多肽类化合物大多由放线菌产生（Panchanathan et al.，2013）。此外植物内生菌具有产生与宿主同样或不同的活性次级代谢产物的能力，对于新药产生途径以及药用植物的保护都具有重要意义。

剑叶龙血树（Dracaena cochinchinensis）广泛分布于我国（云南、海南、广西）及其他东南亚国家，被列入我国国家重点保护野生药材物种名录，属国家Ⅱ级保护植物，《中国植物红皮书—稀有濒危植物（第一册）》（1992年）将其收录为渐危种。龙血树树脂药用，可提取中医传统外伤科用药“龙血竭”，在治疗心血管病、抗炎、抗肿瘤、治疗子宫内膜异位症及止血活血等方面具有较好的疗效。然而，剑叶龙血树生长缓慢，血竭产量低，收获血竭会严重破坏百年生长的植物。本文将研究剑叶龙血树内生放线菌的抗菌和抗肿瘤生物活性，筛选并鉴定活性显著的菌株，并对其发酵条件进行考察，为下一步从中发掘新型抗菌抗肿瘤活性成分奠定基础，并对濒危名贵野生药材剑叶龙血树的保护有一定意义。

1 材料与方法

1.1 菌种

1.1.1 内生放线菌 以中国云南西双版纳及越南地区剑叶龙血树植物组织中分离得到的300余株内生放线菌为材料，由云南大学云南省微生物研究所提供。

1.1.2 病原指示菌 金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus ATCC25923）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC6633）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus 1029）、大肠杆菌（Escherichia coli ATCC25922）、铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa PA01）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium χ 8956）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis ATCC29212）、曼胞不动杆菌（Acinetobacter baumanii ATCC19606）、克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia ATCC13883）、白色念珠菌（Canidia albicans SC 5314）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum） 、炭黑曲霉菌（Aspergillus carbonarius）、赭曲霉菌（Aspergillus westerdijkiae），以上菌株均为课题组前期保存。

1.2 肿瘤细胞株

人乳腺癌肿瘤细胞株MCF-7及人肝癌肿瘤细胞株Hep G2 购买自美国模式培养物保藏中心（ATCC， Boulevard， Manassas， VA 20110 USA）。

1.3 培养基

1.3.1 病原细菌培养基 LB：tryptone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，agar 15 g，ddH2O 1L，pH 7.2～7.6。

1.3.2 病原真菌培养基 沙保氏培养基：glucose 40 g，peptone 10 g，agar 15 g，ddH2O 1L，pH 6.0。PDA：potato 200 g （ 煮沸 20 min 后过滤，取汁弃渣），glucose 20 g，agar 15 g，ddH2O 1 L，pH 6.0～7.0。

1.3.3 放线菌活化增殖培养基 YMG：yeast extract 4 g，glucose 4 g，malt extract 10 g，agar 15 g，ddH2O 1L，pH 7.2～7.6。

1.3.4 发酵培养基 Medium A：mannitol 20 g，peptone 20 g;Medium B：oat 20 g，trace salt 1 mL;Medium C：potato 200 g （ 煮沸 20 min 后过滤，取汁弃渣），glucose 10 g;Medium D：yeast extract 4 g，glucose 4 g，malt extract 10 g;Medium E： peptone 2 g，beef extract 3 g，yeast extract 3 g，glycerol 10 g，K2HPO4 1 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 1 g;Medium F：soluble starch 10 g，glucose 2 g，yeast extract 2 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，（NH4）2SO4 1 g，CaCO3 2 g，NaCl 1 g，trace salt 1 mL;Medium G：soluble starch 2 g，glucose 20 g，yeast extract 2 g，peptone 2 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO3 2 g， NaCl 4 g;Medium H：soluble starch 20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4· 7H2O 0.01 g。以上培养基均为1 L，pH7.2～7.6，agar 15 g。

1.3.5 肿瘤细胞培养基 DMEM培养基。

1.4 主要试剂和仪器

蒸馏水，无水乙醇、甲醇、冰乙酸、乙酸乙酯、丙酮等均为分析纯。N-1000 旋转蒸发仪（EYELA，日本），THI-300 恒温培养摇床（上海一恒科技有限公司），BSA124S 分析天平（德国赛多利斯集团），SW-CJ-2FD 洁净工作台（中国苏州安泰AIRTECH公司），ES-315高压蒸汽灭菌锅（TOMY，日本），DHG-9240A 电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），LRH-250 生化培养箱（上海一恒科技有限公司），SK5200H超声仪（上海科导）。

1.5 方法

1.5.1 内生菌优势菌株的筛选 放线菌在YMG培养基上培养4 d，用含菌的琼脂块扩散法进行放线菌抗病原细菌活性筛选;用平板对峙法进行抗真菌活性筛选;用SRB法测定菌株的细胞毒性。分别用A3F/A7R（700～800 bp）、K1F/M6R（1 200～1 400 bp）、KsaF/KSaR （613 bp）引物进行PCR筛选非核糖体肽合成酶NRPS基因及聚酮合酶PKS-I、PKS-Ⅱ基因（Qin et al.，2009）。

1.5.2 优势菌株的分类分析 对筛选出的阳性菌株进行基因组提取， 利用细菌 16S rRNA 基因通用引物PA： 5′-CAG AGT TTG ATC CTG GCT-3′，PB：5′-AGG AGG TGA TCC AGC CGC A-3′进行PCR扩增。扩增条件：94  ℃预变性 5 min;30个循环（94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min） ，72 ℃延伸 3 min;72 ℃总延伸 6 min。得到的 PCR产物经0.8%琼脂糖胶回收后送生工生物工程 （上海）股份有限公司测序，得到的序列經EzBioCloud （http：//www. ezbiocloud.net/）中的EzTaxon在线比对服务进行相关标准菌株的相似性搜索，确定菌株的分类学地位，并调出相关放线菌的16S rRNA基因序列，随后用Clustal X进行序列比对，最终用MEGA 6软件Neighbour-Joining 法构建系统发育树。

1.5.3 优势菌株产活性代谢产物发酵培养基的优化

1.5.3.1 菌株发酵及提取 内生放线菌接种于YMG培养基平板上，28 ℃恒温培养箱倒置培养3～4 d做为菌种，挑取适量菌丝分别接于A-H 培养基 （25 mL·plate-1），每株菌每种培养基发酵 100 mL，于28 ℃恒温培养箱倒置培养，14 d后将琼脂切块于三角烧瓶中，用乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸 （80∶15∶5）浸泡过夜提取三遍，把琼脂过滤后在旋转蒸发仪上减压浓缩回收溶剂，用有机溶剂将粗提物转至样品瓶，等溶剂完全挥发后，称重计算产量，样品备用。

1.5.3.2 生物活性检测 病原指示菌分别接种至液体LB培养基，白色念珠菌于28 ℃，其余病原细菌于37 ℃，220 r·min-1 震荡培养18 h。用LB液体培养基分别对各指示菌菌液进行梯度稀释，稀释至浓度为 1× 106～1×107 个·mL-1。

采用牛津杯法测定各菌株不同发酵粗提物的体外抗菌活性，指示菌用涂布法或混菌法准备。每个粗提物用 4 mL 丙酮溶解，分别取 50 μL 进行活性测定，取50 μL LB培养基做阴性对照，取50 μL 丙酮做空白对照，取等体积抗生素溶液做阳性对照（病原细菌以5 μg利福霉素为阳性对照;白色念珠菌用20 μg氟康唑为阳性对照）。白色念珠菌于28 ℃培养，其余病原细菌于37 ℃培养，24 h后用游标卡尺测量抑菌圈的直径大小。

劍叶龙血树内生放线菌具有较好的抑菌和抗肿瘤活性，发酵条件明确，菌株易培养且菌种稳定，开发利用前景广阔，部分菌株活性代谢产物的挖掘工作正在积极进行中。

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（责任编辑 周翠鸣）