不同消毒剂对HBV核酸和表面抗原的作用效果研究

邱 丰 周为民 尹文娇 周文亭 曹经瑗 毕胜利 武桂珍

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)隶属于嗜肝DNA病毒科，是一种直径42nm的双链DNA病毒[1～3]。形态学上，HBV由一个27nm的核衣壳和外层包裹的脂蛋白膜共同组成，病毒核酸(HBV DNA)位于核衣壳内，而HBV表面抗原(HBsAg)则镶嵌在外层的脂蛋白膜中[4，5]。自然状态下，过量的HBsAg常以直径为22nm球形或管形颗粒在血液中循环[6，7]。

HBV对外界环境抵抗力较强，国内外常将HBsAg和HBV DNA作为反映病毒是否灭活的指标[8～10]。很多文献证实，30～32℃环境下HBV可存活至少6个月，-20℃时可存活15年。在某些极端条件下，例如121℃高压20min、100℃干烤1h或者100℃直接煮沸10min可确保灭活HBV[11～13]。然而，对于实验室溅洒、滴漏造成的HBV污染，高压干烤等方式显然并不适用。因此，探索各种不同的化学消毒剂对HBV的作用效果就显得尤为必要，之前有研究资料表明，含氯制剂、环氧乙烷、戊二醛、过氧乙酸和碘伏对HBV的灭活效果比较好[14～17]。本研究进一步评价了卫可(Virkon)、增效H2O2等新型消毒剂对HBV的作用效果。

材料与方法

1.实验材料：选择含氯消毒剂(有效氯浓度135～165mg/L)、1%卫可、75%乙醇+增效剂、1.0%过氧化氢+增效剂、1.5%过氧化氢+增效剂5种，其中，含氯消毒剂购自南京净朗源环保科技有限公司，产品批号20171214；维可购自美国杜邦公司；其余3种均购自北京华夏昱凯科技发展有限公司，产品批号分别为201901、201902、201902。HBV病毒原液来自于笔者实验室监测的急性乙型肝炎患者血清，保存于-20℃。原始血清中HBsAg含量为3000IU/ml，HBV DNA含量为5×106IU/ml。

表1 实时荧光定量PCR的引物和探针

结 果

1.病毒浓度(血清稀释度)对消毒剂作用效果的影响：由于实验室通常会面临不同浓度的HBV阳性血清的溅洒情况，这些血清的病毒载量以及HBsAg浓度往往有成百上千倍的差别，为了模拟不同病毒载量和HBsAg的血清对消毒效果的影响，将实验室保存的原始HBV阳性血清作了系列梯度稀释，经消毒剂作用1h后,对HBsAg和HBV DNA两个指标进行检测，发现不同消毒剂的作用效果存在差别。1.0%的过氧化氢和1.5%的过氧化氢对高、中、低浓度的HBV阳性血清均无效，所有稀释度的血清经作用1h后HBsAg和HBV DNA仍然为阳性，含氯消毒剂和75%乙醇对低浓度的HBV阳性血清有一定的效果，但对高浓度血清无效，在本研究所涉及的5种消毒剂中，只有1%卫可对HBV核酸的破坏效果较为明显(表2)。

表2 病毒浓度(血清稀释度)对消毒剂作用效果的影响

2.不同剂量消毒剂对高浓度原始病毒的作用效果：为探索每种消毒剂最佳的使用剂量，分别使用了2倍、4倍、10倍、20倍和40倍的消毒剂与原倍HBV阳性血清作用1h，加入硫代硫酸钠中和后测定了HBsAg和HBV DNA的含量。20倍体积的1%卫可与原倍血清作用后可使HBsAg和HBV DNA两项指标均发生阴转，而其他两种消毒剂都达不到类似效果，增大至40倍体积后仍有指标为阳性，详见表3。

表3 不同剂量消毒剂对原倍HBV阳性血清的作用效果

3.作用时间对消毒剂效果的影响：由于1%卫可消毒剂具有使用剂量较小、作用效果显著等特点，在实验室发生HBV阳性血清溅洒等生物安全事故时，其实用性要强于含氯消毒剂和75%乙醇。而表3的实验数据已经显示20倍和40倍体积1%卫可均能够彻底破坏HBsAg和HBV DNA。在此基础上进一步探索了20倍以及40倍体积1%卫可的最佳处理时间，不论是20倍体积还是40倍体积，1%卫可只有在作用1h之后才能使HBsAg和HBV DNA均发生阴转(表4)。

表4 作用时间对1%卫可消毒剂作用效果的影响

讨 论

长期以来缺乏有效的HBV体外培养模型一直是HBV灭活效果评价的最大阻碍，虽然最近HBV的特异性受体及其体外培养系统取得了突破性的进展，但是该系统中使用的HepG2-NTCP细胞株不易获得，而且HBV体外培养比较耗时费力，因此本研究选择了HBsAg和HBV DNA这两项广泛使用的指标用于评价不同消毒剂的作用效果，一方面是因为这两个指标的检测方法比较成熟，操作简便，价格低廉，检测结果稳定可靠，重复性强；另一方面，HBsAg和HBV DNA作为HBV的两种重要组成成分，在一定程度上也能代表消毒剂对病毒本身的作用效果[8，20]。

目前实验室常用的消毒剂种类繁多，性状各异，之前已有研究证实含氯消毒剂和乙醇处理后并不能使血清中的HBsAg抗原性达到阴性水平，这与本研究的实验结果相符[14，15]。但是，本研究进一步发现，在血清中HBsAg含量较低的情况下(低于30IU/ml)，含氯消毒剂和乙醇的作用效果还是相当明显的，这两种实验室最常用的消毒剂对于低浓度的HBsAg具有较好的破坏作用。

除传统消毒剂之外，本研究还验证了卫可等新型消毒剂对HBsAg以及HBV DNA的作用效果。卫可外观为粉红色粉末，是一种过硫酸氢钾复合盐，属于酸性氧化剂，易溶于水，在实际使用中常配制成1%的溶液，卫可的消毒机制在于通过产生低分子自由基使病原表面蛋白质变性凝固从而杀灭微生物[21，22]。本研究发现，无论是高浓度还是中低浓度的HBV阳性血清，使用20倍体积以上的1%卫可溶液处理1h之后均可使HBV DNA和HBsAg等指标转阴，证实了卫可良好的作用效果。除此之外，卫可相较于其余种类的消毒剂还具备显著的优点。首先，卫可配制方便，配好的溶液内含有特有的粉红色活性指示剂，可以通过颜色的变化判断消毒剂的有效性。其次，卫可挥发性不强，对人体皮肤、呼吸道黏膜和眼睛等部位的刺激较小，对金属的腐蚀作用也比含氯消毒剂要弱，基本安全无害。最后，卫可价格低廉，生产成本比医用乙醇等大多数的消毒剂要低。

综上所述，本研究通过HBsAg和HBV DNA等指标间接地评估了各种消毒剂的作用效果，研究结果对于实验室处理HBV阳性血清溅洒等生物安全事故具有一定的参考价值。采用最新的病毒体外培养体系，建立成熟可靠的评价方法来直接测定HBV的感染性是今后努力的方向。