miR-497-5p-ENAH对肝癌细胞侵袭运动的影响

慕刚刚 朱益洁 于红刚 李红艳

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在我国是最常见的恶性肿瘤之一，发生率和病死率呈上升趋势，肝癌早期发现困难，目前5年生存率只有10.1%[1，2]。对于肝癌发生的机制研究、靶向治疗分子的研究仍是目前研究的重点。

ENAH(enabled homolog)是Ena/VASP蛋白家族一员，Ena/VASP在调控细胞侵袭和转移过程中的形态改变、细胞黏附等发面发挥关键作用[3]。ENAH调控于肌动蛋白，参与癌细胞运动、细胞间黏附、极化发生。之前研究发现ENAH在多种恶性肿瘤中呈现高表达，包括结直肠癌、宫颈癌、胃癌及胰腺癌等,而且ENAH与肿瘤高侵袭性、恶性预后明显相关[4～6]。ENAH是多个肿瘤信号通路的关键靶基因，例如Wnt/β-Catenin信号通路轴、PPARγ信号轴[7]。Enah可以分化为不同亚基蛋白，例如在原发肿瘤中高表达而在转移癌缺乏的亚基，具有侵袭性的亚基蛋白(Mena++、MenaINV)[8]。

本研究发现肝癌组织中ENAH呈现高表达，ENAH与肝癌患者预后有显著相关性，其上游has-miR-497-5p可下调肝癌细胞ENAH的表达，并且通过下调ENAH来抑制paxillin介导的细胞极化、黏着斑成熟及细胞运动。

材料与方法

1.实验对象：收集2018年1月～2019年6月于笔者医院肝癌切除标本(癌及癌旁组织)，本研究通过武汉大学人民医院医学伦理学委员会的批准。

2.细胞及试剂：人肝癌细胞HepG2购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，HepG2培养用DMEM(10% FBS，5%双抗)，37℃孵育箱传代培养。试验用试剂包括抗体有ENAH、GAPDH购自美国Santa Cruz公司，paxillin及磷酸化paxillin -tyr 31抗体购自美国Invitrogen公司，羊抗兔IgG(H+L)、F(ab′)2 Fragment(Alexa Fluor®555 Conjugate)、Acti-stainTM488 Fluorescent Phalloidin购自美国CST公司；miRNA Taqman 探针、Taqman miRNA Multiplex RT Assays 试剂盒均购自美国Applied Biosystems公司。

3.Oncomine数据库：Oncomine是开放的癌症基因芯片数据库和整合数据挖掘平台。本研究设置条件为Analysis Type: Liver cancer vs. Normal Analysis；Data Type: mRNA；over-expression，Gene: ENAH。通过在线分析ENAH在不同肿瘤中及肝癌中的表达差异。

4.The Human Protein Atlas数据库：该数据库也称人类蛋白表达图谱，是研究蛋白在人体正常组织、癌组织和癌细胞系中免疫组化染色状态，可进行肿瘤组织蛋白差异表达分析，并且可进行基因与肿瘤的生存分析。本研究中，对ENAH蛋白在人肝癌组织中免疫组化分析，ENAH与肝癌患者预后进行生存分析。

5.组织蛋白提取及免疫印迹：肝癌、癌旁组织标本经剪碎、研磨，裂解液充分裂解，提取总蛋白，并经过BCA法测定蛋白浓度。免疫印迹过程：取20μg蛋白加入SDS-PAGE上样孔，并电泳分离后电转移至NC膜，采用10% BSA溶液封闭后用一抗4℃孵育过夜，TBST清洗后加入HRP标记的二抗孵育4～6h(4℃)，经ECL法显色后X线胶片曝光并采集图片。

6.组织RNA提取及测定:术后30min内通过液氮罐收集新鲜的临床肝癌、癌旁组织，-80℃冰箱较长期保存备用。参照Trizol RNA提取试剂盒提取组织总RNA，DEPC水溶解，测定RNA纯度和浓度，并取1μl RNA经凝胶电泳测定完整性，进行后续RT-PCR。

7.RT-PCR反应: 依据相关试剂盒操作说明书的步骤操作，应用Primer premier 6.0 软件设计hsa-miR-497-5p 的上游引物、下游引物、反转录引物序列，本研究采用U6为内参。反转录反应体系为：RNA 2μl，引物 1μl，dNTP mix 1μl, U6反转录引物1μl，反转录酶1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，无酶水 9.5μl，设定条件：16℃ 15min，16℃ 15min，42℃ 60min，85℃ 5min，4℃ 5min。qT-PCR采用SYBR法测定miR-6838-5p的Ct值，U6为内参照，反应体系为：混合物(25μl): 引物 2μl，ddH2O 8.5μl，SYBR 12.5μl，cDNA 2μl，条件：95℃ 30s，1个循环，95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。

8.免疫荧光：将(2～3)×104个/毫升 miR-497-5p mimic转染后的HepG2单细胞悬液接种在盖玻片上，经细胞培养至单层。细胞进行免疫荧光试验，PBS洗涤3次，4%甲醛固定15min，0.3% Triton-X 100/PBS透膜15min，5% BSA/PBS+血清封闭1h。加入1∶100稀释的兔抗paxillin一抗溶液，4℃孵育过夜；，再用1∶1000羊抗兔IgG(H+L)，F(ab′)2 Fragment荧光二抗及1∶200的Acti-stainTM488 Fluorescent Phalloidin抗体孵育1h，DAPI染核，置于Olympus 正置荧光显微镜下观察。

9.免疫组化染色及评分:手术切除新鲜肝癌及癌旁组织，经10%多聚甲醛固定48h后，常规制作石蜡切片，常规HE，首先进行抗原修复，修复温度99℃、修复时间30min，然后进行免疫组织化学染色(ENAH抗体购自美国Santa Cruz公司)。评分：组织切片免疫组织化学评分=染色强度分×阳性细胞着色比例分，结果分为阴性：不着色，弱着色，着色细胞<25%；阳性：中等着色，着色细胞25%～50%；强阳性：强着色，着色细胞>50%。

结 果

图1 Oncomine数据库中ENAH蛋白在所有肿瘤中的差异表达分析

1.Oncomine数据库分析ENAH在人体各肿瘤中的差异表达：Oncomine数据库中设定搜索条件“gene：ENAH，P-VALUE：1×10-4；FOLD CHANGE：2；GENE RANK：Top 10%；DATA TYPE：all”，ENAH蛋白在大多数肿瘤中呈现高表达趋势，仅在部分膀胱癌、肺癌、卵巢癌中呈现低表达，这表明ENAH的表达存在不同肿瘤间差异性。本研究关注的肝癌组织中，ENAH在6个肝癌数据集均呈现明显高表达(图1)。

2.Meta分析ENAH在肝癌中差异表达：通过Oncomine在线分析，设定筛选条件“Gene：ENAH，Analysis Type: Cancer vs Normal Analysis；Cancer Type: Liver Cancer；Data Type: mRNA；P-VALUE：1×10-4；FOLD CHANGE：2；GENE RANK：Top 10%”。共有5个数据库满足筛选：Chen liver(cancer：105例，normal=75，P=2.26×10-25)，Roessler liver(cancer：22例，normal=21，P=3.06×10-12)，Mas liver(cancer：38例，normal=19，P=6.27×10-8)，Roessler liver 2(cancer：225例，normal=220，P=2.67×10-81)，Wurmbach liver(cancer：35例，normal=10，P=6.23×10-8)[9～12]。通过Meta分析证实ENAH在上述5个数据库中呈过表达趋势，ENAH mRNA显著高于对照组，P=3.11×10-8，Median Rank 146.5(图2)。

图2 Oncomine数据库分析ENAH在肝癌中的表达差异

3.ENAH在肝癌组织中病理表达：Human Protein Altas数据库，通过免疫组化在线分析ENAH蛋白在肝细胞癌、胆管细胞癌组织中的表达及胞内定位。采用ENAH抗体(No.HPA028696)，免疫组化提示大部分肝细胞癌、胆管细胞癌组织中ENAH表达呈现中、高等强度(肝癌组织 vs 癌旁肝组织：强阳性11 vs 0，阳性23 vs 8，阴性5 vs 29，P<0.05)。IHC提示ENAH蛋白在肝癌细胞内主要分布在胞质、胞膜，这与ENAH主要调控细胞运动相关的肌红蛋白有关(图3、表1)。

图3 ENAH在肝癌组织中的IHC分析A、D.正常肝组织；B、E.胆管细胞癌；C、F.肝细胞癌；A～C.放大倍数为40倍；D～F.放大倍数为100倍

表1 通过免疫组化染色分析ENAH在肝癌组织中表达差异

4.肝癌的ENAH生存分析：收集新鲜肝癌组织、癌旁组织，裂解提取总蛋白，通过Western blot法试验同样证实ENAH蛋白在肝细胞癌、胆管细胞癌中呈现显著高表达， 显著高于癌旁的正常肝组织(图4A)。同样，与正常肝细胞L-O2比较，其他不同肝癌细胞中ENAH均呈现明显的过表达。通过分析TCCG数据库的已有数据，对ENAH进行生存分析，ENAH低表达患者的预后佳(P<0.05)。

图4 ENAH在肝癌组织中表达及生存分析A.肝癌及癌旁组织中的ENAH蛋白表达；B.肝癌细胞系中ENAH蛋白表达差异；C.ENAH蛋白表达与肝癌患者预后的生存分析。N.正常肝组织；T.肝癌组织，*P<0.05

5.has-miR-497-5p抑制ENAH表达及paxillin介导的细胞极化、黏着斑形成：通过软件Targetscan预测ENAH的调控microRNA为miR-497-5p，ENAH的3′UTR第198-204碱基位点与miR-497-5p结合。在肝癌组织中，提取总RNA后通过RT-PCR分析发现肝癌中miR-497-5p水平明显低于癌旁肝组织。在肝癌细胞HepG2中，通过miR-497-5p inhibitor和miR-497-5p mimic分别抑制、增强细胞的miR-497-5p的表达，miR-497-5p mimic诱发的miR-497-5p高表达，间接抑制细胞间黏着斑结构蛋白paxillin的31位点酪氨酸磷酸化(图5)。

图5 has-miR-497-5p抑制ENAH表达及paxillin介导的细胞极化、黏着斑形成(绿色荧光，×400)A.miR-497-5p与ENAH结合位点；B.肝癌组织与正常肝组织的miR-497-5p水平比较；C.miR-497-5p抑制HepG2细胞ENAH蛋白表达、paxillin酪氨酸磷酸化；D.miR-497-5p抑制paxillin介导的HepG2细胞骨架微结构极化、细胞黏着斑形成及成熟

为进一步观察miR-497-5p对细胞骨架微结构、黏着斑形成及成熟的影响，将HepG2细胞进行铺片培养，miR-497-5p mimic转染干预细胞miR-497-5p的表达，免疫荧光观察细胞骨架微结构改变(F-actin为标志蛋白)、细胞间黏着斑形成及成熟(paxillin为标志蛋白)的变化。miR-497-5p mimic抑制miR-497-5p，细胞的paxillin磷酸化受抑制，细胞间黏着斑形成及成熟受限，黏着斑以小为主，散布在胞质、胞膜，与之对应的细胞骨架微结构较紊乱，无明显方向性及集束、聚集发生。而对照组的HepG2细胞中，F-actin标志的细胞骨架微结构发生明显聚集、极化，并向较大的成熟黏着斑聚集、附着，细胞的运动能力明显高于miR-497-5p mimic干预组。

讨 论

ENAH系Ena/VASP蛋白复合物(enabled/vasodilator stimulated phosphoprotein)家族成员，ENAH结合EVL、VASP蛋白形成肌动蛋白调控单位，定位于细胞引导端、黏着斑及伪足，而且通过偶联Integrin α5亚基的胞质C末端，促进细胞侵袭、运动[13]。在多种肿瘤的研究中，已经证实ENAH呈明显过表达趋势，包括肝细胞癌、胃癌、结直肠癌、唾液腺癌、胰腺癌、乳腺癌[14～19]。HU的肝癌研究表明，肝癌细胞中ENAH过表达与肿瘤的分化、进展、预后密切相关，本研究中也证实ENAH在肝癌细胞、胆管细胞癌中明显高表达，而且高表达ENAH提示肿瘤侵袭力增强和更差的预后，前期发现ENAH过表达促进肿瘤EMT、肝纤维化的进展。本研究生存分析也证实，高表达ENAH肝癌患者预后更差，后期研究可以探索ENAH作为肝癌预后的生物学预测标志物。

前期研究指出ENAH主要影响细胞肌动蛋白极化、促进细胞突出或伪足形成、EGF诱导的细胞运动，进而调控细胞的黏附和运动[13]。本研究发现，通过miR-497-5p抑制肝癌细胞内ENAH的表达，间接抑制了HepG2细胞的细胞骨架微结构中肌动蛋白的极化、细胞间黏着斑的成熟及细胞运动。一项ENAH在胃癌的研究表明，ENAH通过激活MAPK(Erk1/2)、AKT信号通路、NF-κB信号通路调控胃癌细胞的增殖、运动，同样ENAH也可促进癌细胞上皮细胞间叶样转变(EMT)，ENAH被敲低表达后，癌细胞EMT相关标志蛋白发生改变：E-cadherin蛋白下调，Vimentin和Fibronectin表达上调，细胞EMT化受到明显抑制。癌细胞的EMT经典调控信号通路包括TGF-β、Wnt/β-catenin和Notch信号通路轴，而敲低ENAH可以有效抑制上述信号通路的激活，并且在结肠癌、乳腺癌、肝癌细胞中都得到不同程度的验证[20，21]。

microRNAs(miRNAs)是一类小分子非编码RNAs，主要抑制基因的转录表达，参与细胞分裂、血管生成、代谢的生物学调控，而且调控肿瘤的发生、进展[22]。miR-497-5p位于染色体17p13.1的位置，系miR-15/16/195/424/497簇的一员，该microRNA簇家族5′端包含AGCAGC序列，在细胞中高度保守。miR-497 目前进行了多种肿瘤的观察研究，在血管肉瘤、子宫内膜癌、非小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌中已证实miR-497发挥抑癌基因的作用，例如miR-497通过Bcl-2诱导乳腺癌细胞的凋亡，在卵巢癌中miR-497抑制PXN2蛋白表达，抑制肿瘤侵袭，通过调控Raf-1HE CCND1的蛋白表达抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭运动。本研究中肝癌组织中miR-497-5p水平显著低于正常肝组织，miR-497-5p能够抑制ENAH的表达，最终抑制肝癌细胞HepG2的细胞极化、黏着斑形成及成熟，抑制细胞的运动、侵袭。

生物信息学是一门新兴学科，它整合了生物学、数学、计算机不同学科的优势，对肿瘤大样本数据进行整合挖掘，数据包括高通量基因、蛋白组学、转录组学数据等。分析肿瘤中基因、蛋白、转录、甲基化等生物调控微小单元的变化，并预测肿瘤表达的差异基因等，从而找出肿瘤治疗的新靶点。本研究中涉及的Oncomine、Human Protein Atlas数据库包括了世界上最大的TCGA、病理数据库，包含了目前为止最大的肝癌临床样本量，所有数据来源于基因芯片，研究方法一致，因此结论具有极高的可信度。本研究通过生物信息学计算，筛选出肝癌与正常肝组织的差异表达基因ENAH，并对其病理表达、预后生存分析，验证了其调控microRNA has-miR-497-5p抑制ENAH表达，并间接抑制肝癌细胞的细胞骨架微结构极化、细胞间黏着斑的形成及成熟，最终抑制肝癌细胞的运动、侵袭。