小分子RNA干扰PTPRO表达对克罗恩病大鼠的保护作用及机制研究

克罗恩病(CD)是一种慢性炎症性肠病，多表现为腹痛、腹泻及脓血样便等，或伴发热[1-2]。CD的临床表现多样，且具有病程长、易反复的特点[3]，给患者的生活带来了严重影响。CD的发病机制尚未完全阐明，多数学者认为其与遗传、环境、肠道免疫功能等有关[4]。Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)与CD的关系密切，TLR4可靶向NF-κB调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)及IL-6等表达水平，进而参与CD的炎性反应[5-6]。受体型蛋白酪氨酸磷酸酶样O(PTPRO)是一种蛋白酪氨酸磷酸酶受体，在肝脏实质细胞中表达[7]。有报道指出PTPRO与TLR4及NF-κB之间具有相关性，并可相互调节[8-9]。本文探究了小分子RNA干扰PTPRO表达对CD的影响及机制，以期为CD的治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

本研究选取40只SPF级的SD大鼠，体质量为180～200 g，购自海南维瑅瑷生物工程技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(琼)2016-0003。所有大鼠适应性饲养1周，期间给予充足的饲料和水，昼夜交替，交替频率为12 h。

HE染色试剂盒、4%多聚甲醛、梯度乙醇均购自上海碧云天生物技术有限公司，PTPRO、TLR4及NF-κB抗体均购自北京孚博生物科技有限公司，总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒均购自瑞士罗氏公司，1658001型垂直电泳槽、PCR扩增仪均购自美国Bio-Rad公司，DYCP-31C型琼脂糖水平电泳仪购自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CD模型的构建及分组 从40只大鼠中随机选取30只，按150 mg/kg给予50% TNBS乙醇溶液灌肠处理构建CD大鼠模型，灌肠后保持大鼠肛门抬高3 min，避免灌肠液流出。其余10只大鼠设为对照组(A组)，按上述操作灌肠生理盐水。将CD模型大鼠随机分为3组：模型组(B组)、空载体组(C组)和干扰组(D组)，每组10只。其中B组尾静脉注射生理盐水5 μL，C组尾静脉注射含空载质粒的慢病毒5 μL，D组注射含si-PTPRO mRNA质粒的慢病毒5 μL[10]。

1.2.2 CD疾病活动指数 CD疾病活动指数评级从3个维度进行：体质量减失率、粪便性状、粪便潜血及肉眼血便。体质量减失率为0，计0分；1%～4%，计 1分；5%～9%，计 2分；10%～14%，计 3分；≥15%，计4分。粪便性状正常，计0分；松散，计1分；松散程度增加，计2分；稀便，计3分；稀便程度增加，计4分。无粪便潜血及肉眼血便，计0分；潜血阳性，计1分；潜血阳性程度增加，计2分；肉眼血便，计3分；肉眼血便程度增加，计4分[11]。

1.2.3 HE染色 断头处死各组大鼠，取肠黏膜组织，用10%多聚甲醛固定24 h，随后洗涤、脱水、石蜡包埋、切片，厚度为4～6 μm，然后HE染色观察肠黏膜组织病理学变化[12]。

1.2.4 RT-qPCR法检测PTPRO mRNA水平 取各组肠黏膜组织，无菌环境中研磨，3 500 r/min离心15 min。取上层清液，提取总RNA。取2 μg总RNA于反转录试剂盒中进行反转录反应。将反转录产物在PCR扩增仪中扩增，反应条件为95 ℃ 预变性5 min，之后95 ℃ 30 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，循环40 次。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量[13]。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.5 肠黏膜组织中IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α水平检测 取各组肠黏膜组织，无菌环境中研磨，3 500 r/min离心15 min。采用酶联免疫法检测肠黏膜组织中IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α的表达水平，试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2.6 Western blot法检测PTPRO、TLR4及NF-κB蛋白水平 取各组肠黏膜组织，加入RIPA裂解液，在4 ℃环境下12 000 r/min离心15 min，取上清液，用BCA蛋白定量测定试剂盒进行蛋白定量。120 V电压电泳，200 mA转膜，脱脂牛奶室温封闭，滴加一抗，4 ℃环境下摇床孵育过夜，PBST洗涤3次，二抗室温孵育2 h，曝光显影。应用ImageJ软件进行灰度值分析[14]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠CD疾病活动指数评分比较

A组、B组、C组和D组的CD疾病活动指数分别为(0.26±0.09)分、(3.48±0.46)分、(3.37±0.52)分和(1.64±0.33)分。与A组比较，B组CD疾病活动指数评分升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组和C组比较，D组CD疾病活动指数评分均降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.2 各组大鼠肠组织病理学变化

由图1可知，A组肠黏膜组织结构清晰、完整，杯状细胞分布均匀，腺管结构完整，未见炎性细胞浸润；B组腺体缺失，黏膜层破坏严重，黏膜固有层有大量炎性细胞浸润；C组与B组相类似；D组肠黏膜组织细胞排列紧密，结构清晰、完整，与A组结果相近。

2.3 各组肠组织中PTPRO mRNA比较

A组、B组、C组和D组肠黏膜组织中PTPRO mRNA相对表达量分别为0.93±0.13、3.52±0.23、3.48±0.27和1.82±0.21。与A组相比较，B组中PTPRO mRNA水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组和C组比较，D组中PTPRO mRNA水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组肠黏膜组织病理学变化 HE染色 ×100 A 对照组 B 模型组 C 空载体组 D 干扰组

2.4 各组肠组织中IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α表达水平比较

由表2可知，与A组相比较，B组肠组织中IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平均升高，IL-10表达水平下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。与B组和C组相比较，D组肠组织中IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平降低，IL-10水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.5 各组大鼠肠组织中PTPRO、TLR4及NF-κB蛋白水平比较

由表3可知，与A组比较，B组肠组织中PTPRO、TLR4及NF-κB蛋白水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组和C组比较，D组肠组织中PTPRO、TLR4及NF-κB蛋白水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 各组肠组织IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α水平比较()

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

表3 各组大鼠肠组织中PTPRO、TLR4及NF-κB蛋白水平比较()

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

3 讨论

PTPRO作为蛋白酪氨酸磷酸酶的受体之一，广泛存在于机体内。已有多项报道指出PTPRO与炎性反应、氧化应激损伤有关，如PTPRO可通过TLR4/NF-κB途径促进氧化型低密度脂蛋白诱导的氧化应激和细胞凋亡[15]；PTPRO可通过正反馈方式激活NF-κB，并使其在肝缺血再灌注损伤中起双重作用[16]。本文主要探究PTPRO在CD中的表达水平，以及抑制PTPRO表达对CD的影响，以期为阐明CD的发病机制提供参考。

本实验比较了各组CD疾病活动指数及HE染色图像，发现B组CD疾病活动指数升高，肠黏膜组织病理发现腺体缺失，黏膜层破坏严重，黏膜固有层有大量炎性细胞浸润，表明CD大鼠模型构建成功。本研究通过尾静脉注射含si-PTPRO mRNA质粒的慢病毒干扰PTPRO表达，结果显示D组肠黏膜组织中PTPRO mRNA及PTPRO蛋白水平均低于B组和C组，表明干扰PTPRO表达成功，并且结果进一步表明干扰PTPRO表达可降低肠黏膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的表达水平，提高抗炎因子IL-10的表达水平，对CD大鼠有一定保护作用。TLR4可靶向NF-κB调节TNF-α、IL-1β及IL-6等的表达水平，进而参与CD的炎性反应[5-6]。本研究比较了各组大鼠肠黏膜组织中TLR4和NF-κB的水平，发现D组TLR4和NF-κB水平低于B组和C组，提示干扰PTPRO表达可降低肠黏膜组织中TLR4和NF-κB水平，进而发挥其保护CD大鼠的作用。

综上所述，干扰PTPRO表达能够抑制TNBS灌肠所引起的肠黏膜损伤，降低CD肠黏膜组织中TLR4和NF-κB水平，进而下调IL-1β、IL-6、TNF-α水平，上调IL-10水平。因此，小分子RNA干扰PTPRO表达可改善CD大鼠肠黏膜组织的炎性反应，其机制可能与调控TLR4和NF-κB表达有关。