基于人工气候培养箱的34 个烟草品种萌发期耐盐性评价

王悦霖，叶协锋，宋佳倩，李雪利，余海涛，荆永锋，姚鹏伟，武云杰，王 静*

1.河南农业大学烟草学院 国家烟草栽培生理生化研究基地 烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州市金水区文化路95 号 450002

2.中国烟草总公司职工进修学院，郑州市鑫苑路7 号 450008

3.湖南中烟工业有限责任公司，长沙市雨花区万家丽中路三段188 号 410000

世界粮农组织在2016 年的报告中提出，土壤盐渍化、有限的耕地面积以及突发的自然灾害使现代农业的发展面临着前所未有的挑战［1］。目前世界盐渍土壤面积约为1.00×1010hm2，中国的盐渍土壤约有3.67×107hm2，我国耕地的次生盐渍土壤面积约为9.20×106hm2，占耕地总面积的6.6%［2］。对我国植烟土壤的研究也发现，部分植烟土壤已出现土壤盐渍化现象。赵莉［3］对湖南植烟土壤盐分调查发现，湖南地区植烟土壤盐分表聚现象严重，从而影响烟草的正常生长以及调制后的烟叶质量。马静等［4］对洛阳典型植烟土壤盐分含量进行分析后认为，洛阳部分植烟土壤已经表现出轻度盐渍化现象。目前，土壤盐渍化的成因大多是由生产中不合理的耕作方式、灌溉、施肥等农业措施带来的，并成为影响农业生产较严重的非生物胁迫之一［5］。

在植物生长过程中，种子萌发期是对外界环境最敏感的时期，也是研究植物耐盐性的重要时期［6］。种子萌发期的耐盐情况可在一定程度上反映该物种的耐盐性［7］，许多植物均以萌发期的耐盐性进行种质的抗盐胁迫评价。近年来，不同学者对花生［8］、谷子［9］、粳稻［10］等作物进行了种子萌发期的耐盐性调查和研究，田蕾等［10］采用相对发芽势、相对发芽率、发芽指数和相对盐害率作为粳稻耐盐性指标，并对64 份粳稻种质进行了耐盐性评价；李明雨等［11］通过主成分分析后选择相对发芽率、相对发芽势和相对活力指数等作为衡量品种耐盐性的相关指标；张志飞等［12］采用主成分分析法计算分析后选择相对活力指数和相对发芽率对66 份白三叶种质进行耐盐性评价。在烟草品种的耐盐性研究中，龚理［13］对不同浓度NaCl 溶液胁迫下7 个品种不同生长时期的耐受性进行了鉴定和评价，得出相对含水率、单株干质量、相对电导率、MDA、K+含量、最大叶长、发芽指数、株高、发芽势、叶绿素含量、蛋白质含量和根系活力等12个指标在NaCl 浓度为150 mmol/L 时变异系数最大，可作为耐盐性定量鉴定的指标。叶协锋等［14］在种子萌发期选用不同浓度的复合盐碱处理，研究了5 个烤烟主栽品种的发芽特性。然而在目前的研究中对于不同烟草类型种质的耐盐性则鲜见报道。为此，采用NaCl 模拟盐胁迫环境条件，对烤烟、白肋烟和香料烟的34 个品种在萌发期进行耐盐性评价与分级，以期为烟草耐盐品种选育和植物耐盐机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟草种质选自国内外烟草种植主产区的主栽品种和典型品种，品种名称与来源见表1。

表1 供试材料及来源Tab.1 Sources of test germplasms

1.2 试验方法

1.2.1 盐胁迫浓度筛选

以K326 品种作为筛选NaCl 浓度的试验材料。选取均匀饱满的种子，用0.2%高锰酸钾溶液消毒，浸泡30 min 后，用去离子水冲洗10 次，洗净种子表面残留的高锰酸钾后，在超净台上均匀地点播在MS 培养基中。待6 d 后从培养基中挑选根长为7～8 mm 的烟草幼苗，分别转移到加有50、100、150、200 和250 mmol/L NaCl 的新MS 培养基中；移入新培养基的日期记为第0 天，在盐胁迫第5 天时测量各处理烟草幼苗根系长度，统计根系伸长值，计算出能够引起根伸长下降50%的NaCl 浓度（EC50）［15］。

1.2.2 各品种耐盐性评价

选取均匀、饱满的种子；使用0.2%高锰酸钾溶液消毒，浸泡30 min 后，用去离子水冲洗10 次，洗净种子表面残留的高锰酸钾后备用。

各品种均设置胁迫处理和对照，每个处理设置3 次重复，每重复100 粒种子。采用洁净灭菌后的玻璃培养皿、脱脂棉及滤纸，采用1.2.1 节中筛选出的最适浓度的NaCl 溶液作为培养液进行胁迫培养，以去离子水作为对照培养。在洁净的培养皿中将湿灭菌后的脱脂棉和滤纸用盐溶液和去离子水浸湿后，铺平在培养皿中，在表层滤纸上均匀点播100 粒消毒后的种子，在人工气候培养箱（MGC-350BP-2L，上海一恒科学仪器有限公司）中培养。设置光强为4 950 Lx，光照时长为12 h/d，相对湿度60%，温度为26 ℃。每日定时观察，及时补充去离子水或150 mmol/L NaCl 溶液，并统计种子发芽粒数，以胚根超过种子长度的1/2 为发芽标准［14］。在培养第14 天时，从每个培养皿中随机选出10 棵幼苗测量根长。测定指标［14］：

发芽势（Germination potential，GP）=（培养7 d种子发芽数/供试种子粒数）×100% （1）

相 对 发 芽 势（Relative germination potential，RGP）=盐胁迫下发芽势/对照处理下发芽势×100%（2）

发芽率（Germination rate，GR）=（培养14 d 种子发芽数/供试种子粒数）×100% （3）

相对发芽率（Relative germination rate，RGR）=盐胁迫下发芽率/对照处理下发芽率×100% （4）

萌发指数（Germination index，GI）=∑（第n 天种子发芽数/相应发芽天数） （5）

相对萌发指数（Relative germination index，RGI）=盐胁迫下萌发指数/对照处理萌发指数×100% （6）

活力指数（Vigor index，VI）=GI×S（S 指种苗生长量，为胁迫14 d 的根长）×100% （7）

相对活力指数（Relative vigor index，RVI）=盐胁迫下活力指数/对照处理下活力指数×100%（8）

相对盐害率（Relative salt injury rate，RSIR）=（对照发芽率-处理发芽率）/对照发芽率×100%（9）

1.3 数据处理

采用DPS 7.0 和SPSS 24.0 软件进行数据统计分析，使用相关性分析和因子主成分分析方法对各项观测指标的相对值进行耐盐性评价指标筛选；利用主成分分析计算得到各指标的得分系数和累计贡献率，采用权重公式得到各品种的综合得分，选择欧氏距离组间平均连锁法对34 份材料耐盐性总值进行聚类分析，并划分耐盐等级。

式中：Pj表示j 个指标的贡献率；Wj表示第j 个指标的权重。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫浓度的筛选

在不同的盐浓度处理下，幼苗的根系呈不同的生长状态，表现出低浓度促进生长而高浓度抑制生长的规律。由图1 可知：在50 mmol NaCl 处理下，烟草幼苗根长较对照增加2.32%；在100 mmol NaCl 处理下，根长较对照降低30.13%；在150 mmol NaCl 处理下，根长较对照降低53.15%；而在250 mmol NaCl 处理下，根长较对照降低80.30%。以引起烟草幼苗根长下降50%的NaCl 浓度（150 mmol/L）作为后续试验中的盐胁迫处理浓度。

图1 不同浓度盐胁迫处理下K326 根长增加量的变化Fig.1 Increases in root length of K326 under different salt stress treatments

2.2 盐胁迫对不同烟草品种萌发期生长的影响

34 个烟草品种在盐胁迫处理下与其对照相比，发芽率和根长等表征指标均呈现显著下降趋势，胁迫处理下各品种较对照表现出黄化现象（图2）。在对照条件下，培养7 d 时各品种发芽势表现不一，变异系数达12.83%（表2），说明不同品种间本身存在一定的差异；培养14 d 时，各品种发芽率均高于67%，其中发芽率高于80%的品种占58.8%，说明烟草种子的活力较为一致。在盐胁迫下，各品种的发芽情况差异明显，其中盐胁迫处理发芽情况较好的品种有YC01、YC03 和YC32，发芽率均超过60%，尤其是YC32 品种发芽率超过80%；盐胁迫处理下发芽率在30%～60%的有6 个品种，在10%～30%的有13 个，盐胁迫下品种发芽率低于10%的共12 个，其中品种YC15 对盐胁迫高度敏感，发芽率为0；各品种的根系生长都受到抑制，根长小于1 mm 的有7 个品种（占20.59%）；根长1～2 mm 的有17 个品种（占50%）；根长＞2 mm的有10 个品种（占29.41%），其中以YC32 根长表现最为突出，为4.95 mm。各品种的相对盐害率都处于较高的水平，说明各品种在盐胁迫条件下都受到较大的伤害；YC01、YC26 和YC29 等品种表现较为突出，其相对盐害率较低。在胁迫处理下不同烟草品种的各项指标变异系数均较对照提高，不同品种的平均发芽率由81.76%降低到24.93%，根长平均值由18.16 mm 降低至1.64 mm，活力指数在胁迫处理后比对照组降低90.95%。这表明在盐胁迫条件下，各品种烟草的生长发育都受到了抑制。盐胁迫处理下各烟草品种单一盐害指标的变异系数较大，尤其是活力指数的变异系数高达195.42%，说明34 个品种在盐胁迫培养的条件下生长情况差异较大。从各指标的变异系数来看，在对照和盐胁迫处理下变异系数最大的指标均为活力指数，说明活力指数是最能反映各品种间发芽情况差异的指标。无论是直观的盐害指标还是综合的盐害指标在各品种之间波动都较大，分层明显，说明不同品种之间耐盐性差异显著。

图2 不同耐盐性品种对照和盐胁迫处理的发芽率比较Fig.2 Germination rates of different salt tolerant germplasms under the salt stress and control treatments

表2 34 个烟草品种盐胁迫处理和对照的表征指标统计Tab.2 Statistics of characteristic indexes of 34 germplasms under the salt stress and control treatments

表2 （续）

2.3 不同品种综合性耐盐指标的相关性分析

对34 个不同烟草品种各相对指标之间进行两两相关性分析，结果见表3。相对发芽势与各项指标均无显著相关性，相对盐害率与大部分指标之间都存在极显著负相关关系，特别是相对盐害率与相对萌发指数两个指标之间的相关系数高达-0.79。除相对发芽势外，相对发芽率、相对发芽势、相对萌发指数和相对活力指数之间均存在正显著相关关系（P＜0.05）或正极显著相关关系（P＜0.01），各指标之间关联密切，相对活力指数与相对萌发指数两个指标的相关系数高达0.88，相对发芽势与所有指标均无显著相关关系。

表3 不同品种盐害评价相对指标的相关性分析①Tab.3 Correlation analysis of relative indexes for salt damage evaluation of different germplasms

2.4 不同品种综合性耐盐指标主成分分析

对34 个烟草品种的6 个相对指标进行主成分分析，提取得到2 个主成分。主成分Ι的特征值为3.575，贡献率为59.591%；主成分Ⅱ的特征值为1.402，贡献率为23.999%；两者的累计贡献率达到83.59%，满足各主成分特征值大于1，累计贡献率大于80%的条件，因此这2 个主成分可以涵盖各品种萌发期在盐胁迫培育下的主要耐盐情况。结合各因子载荷矩阵与得分系数（表4）可以看出：在主成分Ι中相对发芽率、相对萌发指数、相对根长和相对活力指数都具有较高的正向载荷，均在0.8 以上，相对盐害率具有较高的负向载荷，根据各项指标的得分系数可得到第一主分量F1=0.22×RGP+0.49×RGR+0.45×RTL+0.49×RGI+0.43×RVI-0.38×RSIR。在主成分Ⅱ中只有相对活力指数具有较高的正向载荷，载荷量为0.56，其他指标在主成分Ⅱ中载荷量都较低，其中相对发芽势、相对发芽率和相对根长均为负向载荷，相对萌发指数和相对盐害率为正向载荷。根据主成分Ⅱ的得分系数情况可得出第二主分量F2=0.14×RGI+0.47×RVI+0.12×RSIR-0.12×RGP-0.12×RGR-0.2×RTL。

表4 综合性耐盐指标在主成分Ⅰ和主成分Ⅱ的因子载荷及成分得分系数Tab.4 Factor loading and component score coefficient of comprehensive indexes of salt tolerance in principal component I and principal component Ⅱ

2.5 不同品种耐盐性聚类分析

根据主成分的累计贡献率情况可得出两个主成分的权重分别为71.55%和28.45%，因此根据权重公式来计算出各品种最后得分F 值，采用综合得分F 值来对各品种进行排序（表5），并采用欧式距离和组间平均距离连锁法对34 个品种进行聚类分析，从而评价各品种的耐盐性。34 个烟草品种按照耐盐性在欧氏距离10 处可划分为4 类（图3）：由表6 整理可得：高耐盐品种仅有1 个，为YC32 香料烟巴斯玛（选取得分F 值为0.78），这与之前的观测相符合；较耐盐品种5 个，以K326（选取得分F 值为0.53）和DS26（选取得分F 值为0.51）为代表，占总品种数的14.7%；较敏感品种10 个，以中烟100和Spt168 为代表，占总品种数的29.4%；高敏感品种18 个，以NC82（选取得分F 值为-0.24）和K346（选取得分F 值为-0.05）为代表，占总品种数的52.94%。

表5 34 个品种特征值排序Tab.5 Rank of 34 germplasms in the order of characteristic values

图3 34 个品种的聚类分析Fig.3 Cluster analysis of 34 germplasms

表6 34 个品种耐盐等级分类Tab.6 Classification of 34 germplasms based on salt tolerance

3 讨论

有研究证明，在植物萌发期的发芽率和根长会随着盐胁迫浓度升高而降低［10-16］；外界盐胁迫主要是通过渗透胁迫对植物造成伤害，从而使种子失去萌发和继续生长的能力［17］。在植物的苗期，盐胁迫对植物的伤害更多体现为叶绿素含量和干物质积累量的减少［18-20］、MDA 含量的上升、抗氧化酶活性的变化以及脯氨酸和可溶性糖含量的变化［21-23］；外界高浓度盐离子会与植物生长所需的无机离子产生缬抗［24-25］从而造成缺素，影响植物的正常生长。此外，过高的渗透压也会影响植物的细胞壁厚度和亚细胞结构［26］。在评价不同作物萌发期的耐盐性时，衡量各品种耐盐性的指标也有较大差异［27］。韩飞等［28］选择发芽率、发芽指数、相对盐害率和相对根长等指标作为评价63个谷子品种耐盐性的主要指标，而孙东雷等［8］则选用活力指数、发芽率、鲜质量、相对含水量等指标来鉴定花生品种的耐盐性。此外，赵俊香等［16］在研究菊芋品种耐盐性中除了常规的干质量、鲜质量指标之外还添加了MDA、脯氨酸等生理指标的测定。综合上述指标，并结合烟草种子的大小和萌发特性等实际因素，本试验中采用发芽率、活力指数、根长等指标的相对值进行分析，经过主成分分析后可以得到两个主成分综合权重最高的指标，即最能反映各品种在盐胁迫下发芽情况的指标为相对活力指数，得分紧随其后的指标为相对萌发指数。因此在本试验的评价体系中确定的指标为相对活力指数和相对萌发指数。

在本试验中，34 个烟草品种在盐胁迫处理下的表征指标都受到了较严重的影响，各品种发芽率降低，根长明显变短，生长缓慢，且大部分品种发芽率较对照下降50%以上，盐胁迫处理下烟草幼苗出现黄化的现象。各品种在胁迫处理后，各鉴定指标变异系数变大，说明品种之间差异较大且不同耐盐性种质之间分层明显。在盐胁迫下各指标的变异系数呈现活力指数＞发芽势＞萌发指数＞发芽率＞根长＞相对盐害率的趋势，这说明盐胁迫在烟草种子萌发时期的伤害是先通过影响种子萌发的渗透势条件，进而再影响根长的伸长来限制烟草的生长发育。在划分的4 个耐盐等级中，高耐盐种质香料烟巴斯玛在胁迫后的根长仍可达到5 mm 左右，发芽率高达86%，其耐盐表现最为突出。

此外，本试验中收集的烟草品种还包括雪茄烟和地方晾晒烟等10 余个，但由于这些品种的生育期和萌发期特性与大多数品种不同，不能满足本试验评价体系的要求，故无法对其耐盐性进行评价。因此，若要更加全面地分析不同类型烟草品种的耐盐性，还需要对烟草品种的不同时期生理生化和遗传特性等进行更深入研究。

4 结论

在人工气候箱培养条件下，对34 个烟草品种进行萌发期耐盐性综合评价结果表明：①盐胁迫影响烟草幼苗生长的EC50为150 mmol/L。②根据不同烟草品种萌发时期的相对指标提取出2 个主成分，通过隶属函数值方法将34 个品种划分为高耐盐品种（香料烟Basma）、较耐盐品种（烤烟K326、云烟87，白肋烟DS26、va1061 和va509）、较敏感品种（烤烟Spt168、中烟100、NC89、秦烟97，白肋烟KY907、TN86、va1048、TN90，香料烟沙姆逊和伊兹密尔）和高敏感品种（烤烟NC82、K399、吉烟9 号、RG11、秦烟96、NC55、NC567、NC95、遵烟6 号、K394、岩烟97、K358、红花大金元、Hicks、K346、Coker176、CV87，白肋烟va1052）4 个等级。