不同剂量瘦素经侧脑室注射对老年糖尿病模型大鼠血糖及胰岛素相关指标的影响

董迎

(天津北辰医院内分泌科，天津 300400)

老年2型糖尿病作为一种临床十分常见的进展性的内分泌代谢疾病，与人们的生活方式密切相关，对患者的身体健康造成严重的影响〔1〕。2型糖尿病患者体内会有胰岛素表达的缺陷，目前临床上治疗2型糖尿病多采用增加外源性胰岛素，但长期使用效果往往不太理想〔2,3〕。瘦素(LP)是由脂肪组织分泌的一种蛋白质，能够对机体的血糖水平进行调控，但是关于其对胰岛素相关指标影响的研究还较少〔4〕。本文研究使用不同剂量的外源性LP对糖尿病模型大鼠进行干预，旨在探究其对血糖及胰岛素相关指标的影响。

1 材料与方法

1.1材料 研究动物：50只健康SD雄性大鼠，由广西医科大学实验动物中心提供，18～20月龄，平均(3.8±1.5)月龄，体重300～350 g，平均体重(220±7.9)g。大鼠均养殖在干净笼子里，室温在(22.1±1.8)℃，相对湿度35%～40%，每天光照12 h，喂饮纯净水，饲养时间为1 w。本实验获得医院伦理委员会批准。

主要试剂、仪器：兔抗人LP抗体、LP受体(Ob-R)抗体(BD公司)；大鼠抗小鼠空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)抗体(Sigma公司)；兔抗小鼠空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)抗体(Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)抗体(Hyclone公司)；兔抗大鼠血清趋化素(Chemerin)抗体(BD公司)。

1.2方法

1.2.1建模及处理 随机选取10只大鼠作为正常组，使用普通饲料对正常组大鼠进行喂食。使用高糖高脂饲料喂养剩余大鼠，喂养1个月后，使用链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg对大鼠进行腹腔内注射，之后再次使用高糖高脂饲料喂养1个月。取大鼠尾部静脉血进行血糖测定，连续1 w时间空腹血糖>16.7 mmol/L，且有饮食量增加、生长缓慢及身体消瘦等临床表现的大鼠为糖尿病模型建立成功，最终建模成功38只，将38只糖尿病模型大鼠随机分为模型组、高剂量组各9只及低、中剂量组各10只。对4组大鼠进行麻醉处理后将其分别放置于脑立体定位仪上，将大鼠的牙齿扣于齿杆上并将鼻夹扭紧，在大鼠双耳的外耳道中插入耳杆，并且使两侧的耳杆刻度保持一致。对大鼠的躯体进行适度调节，使身体与头部保持同一水平位置，并进行固定。对大鼠的头部皮肤进行消毒后剪开，使用手术刀片将骨膜剥离，并使用过氧化氢进行灼烧，使大鼠冠状缝与矢状缝的交点完全显露出，并进行标记。使用电动颅骨钻在此标记点部位做一直径为0.5 mm的小孔，将装有注射液的微量进样器自小孔部位插入至4.5 mm深时停止,对大鼠的呼吸状况进行观察，若无异常表现，则将注射液缓慢注射，正常组、模型组大鼠注射生理盐水8 μl/kg，低剂量组大鼠注射LP 2 μl/kg，各剂量组按照低∶中∶高=1∶2∶4比例注射瘦素。注射结束后将注射器缓慢取出并对伤口进行抗感染处理，待所有大鼠清醒后进行单独饲养。见图1。

A：使用脑立体定位仪将大鼠头部固定；B：使用微量进样器将LP注入大鼠侧脑室部位图1 侧脑室脑立体定位及大鼠侧脑室注射LP

1.2.2标本采集 对所有大鼠禁食4 h，之后分别取4组大鼠尾部静脉血5 ml,在抗凝管中保存，之后使用转速为3 000 r/min的离心机，离心处理20 min，放入洁净的EP试管中，分离上层血清，在-80℃环境中保存，待用。

1.2.3Western印迹检测LP、Ob-R水平 待测标本进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液，静置15 min；在100 V的环境中电泳10 min后，将电转膜放置在37℃的封闭环境中的摇床上，然后加入10%的牛奶，静置1.5 h后加入TBST稀释，按(1∶1 000)稀释，在5℃的环境下，经过孵育后过夜保存；第2天使用TBST缓冲液清洗，在室温的环境中与二抗结合，孵育1 h后再次用TBST缓冲液清洗，最后将其浸泡在底物溶液中进行显色，采用BCA蛋白定量试剂盒，分析其灰度值，目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值=目的蛋白相对表达量，达到检测LP、Ob-R水平的目的。

1.2.4免疫透射比浊法检测FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR水平 将待测标本放入特定蛋白分析仪中，利用比浊计测定光的密度值，分析FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR的水平，并进行组间比较。

1.2.5化学发光法检测TG、TC水平 采用化学发光法对4组大鼠的TG、TC水平进行检测，待测标本加入化学发光物质，与催化剂发生催化反应，与氧化剂发生氧化反应，形成处于激发状态的中间体，当中间体达到稳定时，会发射出光子，严格按照化学发光分析仪操作步骤，利用发光信号测量仪测量光子数值，对比分析TG、TC水平。

1.2.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清Chemerin水平 提取已采集的血清样本，将待测的标本和酶标物严格按照ELISA试剂盒说明书操作步骤测定Chemerin的水平。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0统计软件进行重复测量数据方差分析、F检验、独立t检验。

2 结 果

2.1各组LP、Ob-R水平对比 正常组LP水平显著低于模型组和各剂量组，Ob-R显著高于模型组和各剂量组(P<0.05)。模型组LP水平显著高于各剂量组，Ob-R显著低于各剂量组(P<0.05)。高剂量组LP水平显著低于低、中剂量组，Ob-R显著高于低、中剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组LP、Ob-R水平对比

与正常组相比:1)P<0.05；与模型组相比:2)P<0.05；与低剂量组相比:3)P<0.05，与中剂量组相比:4)P<0.05；下表同

2.2各组血清FBG、HbA1c水平对比 模型组FBG、HbA1c水平显著高于正常组(P<0.05)，各剂量组FBG、HbA1c水平均显著低于模型组，且高剂量组FBG、HbA1c水平显著低于低、中剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清FBG、HbA1c水平对比

2.3各组血清FINS、HOMA-IR水平对比 模型组FINS、HOMA-IR水平显著高于正常组(P<0.05)，各剂量组FINS、HOMA-IR水平均显著低于模型组，且高剂量组FINS、HOMA-IR水平显著低于低、中剂量组(P<0.05)。见表3。

表3 各血清FINS、HOMA-IR水平对比

2.4各组血清TG、TC、Chemerin水平对比 模型组TG、TC、Chemerin水平显著高于正常组(P<0.05)，各剂量组TG、TC、Chemerin水平均显著低于模型组，且高剂量组TG、TC、Chemerin水平显著低于低、中剂量组(P<0.05)。见表4。

表4 各组血清TG、TC、Chemerin水平对比

3 讨 论

2型糖尿病作为一种临床十分常见的进展性的内分泌代谢疾病，与人们的生活方式密切相关，对患者的身体健康造成严重的影响〔5,6〕。2型糖尿病症状的发生与许多因素有着直接或间接的关系，例如遗传因素、社会发展因素、生活习惯及环境因素等〔7〕，近些年来，随着社会的不断发展，人们生活水平不断提升，饮食结构也随之改变，而不良饮食习惯与生活习惯导致2型糖尿病发病率一直居高不下，在世界范围内，2型糖尿病症状的发病率和死亡率一直呈现不断上升趋势〔8〕。2型糖尿病患者的主要临床表现为“三多一少”，即多尿、多饮、多食和体重下降，也有些患者会出现乏力、视力下降等症状，而患者身体长期处于高血糖状态，很有可能会导致慢性神经损害和功能障碍症状〔9〕。此外，2型糖尿病症状还伴有多种并发症，是除心血管疾病和恶性肿瘤之后的另一种严重威胁人身体健康和生命安全的非传染性疾病〔10，11〕。

Lp是一种能够对机体的摄食及能量平衡等进行调控的物质，还能够调节机体的内分泌免疫机制〔12〕，有学者通过实验研究表明，低剂量的外源性Lp能够降低糖尿病模型大鼠的血糖水平，但是，关于高剂量的外源性LP对糖尿病模型大鼠血糖水平影响的研究还相对较少〔13〕。本文研究中使用不同剂量LP对糖尿病模型大鼠进行干预，结果显示，在较高剂量外源性LP的干预下，糖尿病模型大鼠的LP、Ob-R及FBG水平受到明显调控而趋近于正常水平，说明较高剂量的外源性LP能够调节糖尿病大鼠的血糖水平及LP水平。

TG和TC在2型糖尿病的发生和发展过程中起到重要作用〔14〕，有相关研究表明，TG和TC表达水平较高患2型糖尿病的概率会更高，因为TG、TC的高表达会导致内皮受损及氧化应激反应的发生，从而引起炎症介质的高表达，致使血糖水平升高〔15〕。TG水平升高在2型糖尿病症状的形成过程中发挥着重要的作用，而且高水平的TG还能够引起胰腺炎，使胰岛素分泌障碍，导致1型糖尿病的发生，甚至还会引起不可逆性胰腺炎的发生，形成永久性的1型糖尿病。虽然可以通过药物将TG的高表达控制在正常水平范围内，但是仍会表达为高血糖〔16〕。有相关研究表明，脂肪组织是人体重要的内分泌器官，能够分泌出与机体能量代谢相关的激素和细胞因子，而且这些因子在2型糖尿病的发病机制中都具有重要的作用，并且越来越受到人们的重视〔17〕。Chemerin是近些年发现的脂肪细胞因子新成员，也是一种脂肪细胞分泌出来具有趋化作用的膜结合蛋白，在人体的多种组织中广泛表达，包括肾上腺、肝脏、胰腺、卵巢、胎盘、皮肤、肺等，主要表达于肝脏和肺〔18〕。Chemerin能够对脂肪细胞的分化、代谢起到调节作用，还会促进脂肪分解效应的产生，增强胰岛素刺激引起的葡萄糖摄取〔19〕。本文研究结果显示，使用较高剂量的外源性LP对糖尿病模型大鼠进行干预，能够有效控制糖尿病模型大鼠血清TG、TC、Chemerin的表达水平，从而能够缓解其内皮受损程度及氧化应激反应，还能增强脂肪分解效应。FINS、HOMA-IR是两种常见的胰岛素相关指标，常用于糖尿病症状的临床检测〔20〕。对FINS、HOMA-IR进行检测，能够较为直观地反映出机体内胰岛素水平。本文研究结果显示，使用较高剂量的外源性LP对糖尿病模型大鼠进行干预，能够明显抑制模型大鼠FINS、HOMA-IR水平，说明较高剂量的外源性LP能够对机体胰岛素指标进行调控。

综上所述，经侧脑室注射外源性的LP能够对糖尿病模型大鼠的血糖、胰岛素相关指标进行调控，且较大剂量的外源性LP干预效果更加明显，为糖尿病症状的临床治疗提供了一定的参考。