硒多糖抗肝细胞癌效应与硫氧还蛋白1的关系

张宁 邱佳 张安龑 宫路路

(1遵义医药高等专科学校,贵州 遵义 563000；2遵义医科大学第二附属医院)

肝细胞癌(HCC)是全球第五大最常见的恶性肿瘤〔1〕。流行病学数据显示，全球每年新发HCC病例超过78万，其中我国约占50%〔2〕。肝癌也成为第二大致死癌症，5年生存率低于20%〔3，4〕，原因在于大多数患者在确诊时已属中后期或晚期。尽管临床上有些药物已被用来治疗HCC，但是整体效果欠佳，易出现副作用〔5〕。灵芝是一种高效的抗肝癌中药材，可增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝等作用，硒多糖是灵芝中的一种重要药用成分，并在灵芝抗肝癌过程中扮演了十分重要的角色，但硒多糖的抗肝癌机制尚不清楚。

1 材料和方法

1.1实验材料、器材和试剂 细胞操作间、液氮罐、高压灭菌锅、恒温水浴锅、玻璃平皿、移液器、细胞培养箱、倒置显微镜、96孔板、6孔板、低速离心机、EP管、干式变性仪，电泳、转膜等相关设备，胶片；显影液、定影液，十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)配制试剂，抗生素，低糖的DMEM培养基，胎牛血清，MTT试剂，二甲基亚砜(DMSO)，硒多糖，细胞凋亡相关蛋白抗体(CST)如Caspase-3、Caspase-9等。硫氧还蛋白(Trx)-1一抗、β-actin及二抗(Santa Cruz)。

1.2细胞、细胞培养及药物浓度 本实验所用人HCC细胞株HepG2购买于中国科学院昆明动物研究所。HepG2细胞用低糖的DMEM培养基在37℃含有5%CO2和95%湿度培养箱中培养，DMEM培养基含有10%热灭活的胎牛血清和抗生素(100 IU/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)。取对数生长期细胞用于实验。当细胞生长密度在75%左右时加药处理。用新鲜DMEM培养基配制不同浓度的实验药物溶液。浓度效应实验药物浓度设为0、50、100、200、400 μg/ml，作用时间24 h。

1.3MTT法检测硒多糖对HepG2细胞活力的影响 将细胞于生长对数期消化，离心去掉培养基，然后加入新培养基使其悬浮混匀，并将悬浮均匀的HepG2细胞接种到96孔板中，细胞密度约1×104/ml，每孔100 μl，平行孔为6个为宜，然后每孔再加入不同浓度待测化合物完全培养基100 μl，并放置在培养箱里培养。培养24 h后，加入20 μl MTT溶液，继续培养4 h。离心去上清，每孔加入150 μl的DMSO，置于水平摇床上震荡使其充分溶解。使用酶标仪在570 nm条件下测定OD值，利用相应软件计算细胞增殖抑制率。化合物浓度为0、50、100、200、400 μg/ml。

1.4Western印迹检测硒多糖对HepG2细胞Trx-1及凋亡相关蛋白表达的影响 将药物处理后的细胞收集离心，去上清，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，再次离心去上清。加入细胞裂解液裂解。裂解充分后离心取上清，利用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒对待测样品定量。然后根据目的蛋白的特性依次是制样、电泳、转膜、封膜、洗膜、标一抗、洗膜、标二抗、洗膜、孵育发光底物和曝光显影。用Image J软件对条带进行分析。

1.5结果与分析 采用统计分析软件GraphPad Prism6进行方差分析。

2 结 果

2.1硒多糖对HepG2细胞活力的影响 硒多糖能够使HepG2细胞活力呈现浓度依赖下降的趋势，相比于0 μg/ml组细胞活力(1.00±0.08)，50 μg/ml和100 μg/ml组(1.00±0.11和0.91±0.08)均无显著变化(P>0.05)；200 μg/ml和400 μg/ml组细胞活力(0.78±0.04和0.65±0.05)均较其他浓度组出现显著下降(P<0.05)。200 μg/ml、400 μg/ml硒多糖刺激时出现细胞活力较其他浓度显著下降(P<0.05)。

2.2硒多糖对HepG2细胞Trx-1表达的影响 随着硒多糖浓度增高，HepG2细胞内Trx-1表达量不断降低，200、400 μg/ml硒多糖组Trx-1表达较其他浓度组显著降低(P<0.01)，见图1，表1。

2.3硒多糖对HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的影响 随着硒多糖浓度增高，Caspase-3、Caspase-9的表达量升高，Caspase-3在200 μl/ml时开始出现显著变化(P<0.01)，Caspase-9在100 μl/ml时开始出现显著变化(P<0.05)，见表1，图2。

1～5:0、50、100、200、400 μg/ml硒多糖组，下图同图1 硒多糖对HepG2细胞内Trx-1表达的影响

表1 硒多糖对HepG2细胞内Trx-1、Caspase-3和Caspase-9表达的影响

与0 μg/ml组比较：1)P<0.01；2)P<0.05

图2 硒多糖对HepG2细胞Caspase-3、Caspase-9表达的影响

3 讨 论

HCC的发病率因地理区域而异，与各种危险因素有关，包括乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染、肝硬化(炎症和纤维化引起的慢性肝损伤)、酗酒、老年、男性、代谢综合征和黄曲霉毒素B暴露等。尽管目前有些药物如索菲拉尼在延长HCC患者生存期等方面有一定优势，但因复发、转移、副作用和耐药性等原因，总体效果不太明显〔6，7〕。因此，HCC的治疗迫切需要更安全有效的新型药物。

灵芝是我国一种具有悠久历史的药用真菌，是一种珍贵的滋补偏方。硒是机体生理活动必需的微量元素之一，在提高机体免疫力、抗氧化、抗肿瘤方面均发挥着重要作用〔8〕。硒多糖作为一种有机硒化合物，既保持了多糖较高的生物利用率又具有硒的生物功能，对生物体的毒性大大降低，且活性明显高于硒和多糖〔9〕。硒多糖具有调节健康小鼠免疫功能的作用〔10〕。

Trx-1是一个在动物体内广泛分布的氧化还原调节蛋白〔11〕，Trx-1在多种肿瘤组织中表达增高，与癌症的关系密切，具有促进癌细胞的生长，抑制癌细胞凋亡作用〔12〕，因此，Trx-1已成为癌症的治疗的一个重要靶点，Trx-1调控的细胞凋亡也成为治疗肿瘤细胞生长的一个潜在治疗途经。细胞凋亡在正常情况下，在消除受损细胞以维持体内平衡方面发挥着重要作用。然而，凋亡信号通路的缺陷可以刺激肿瘤发生，促进癌细胞存活。因此，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗癌症的方法之一。Bcl-2家族蛋白和Caspase级联在细胞凋亡调控中发挥重要作用。Bcl-2家族分为抑制凋亡和促进凋亡蛋白两大类，Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用，Bax是线粒体外膜的促凋亡蛋白；它促进凋亡分子的内在凋亡释放〔13〕。在神经瘤细胞中用干扰Trx-1的表达，Bcl-2的表达量明显下降并且线粒体膜电位改变，Caspase-3被激活，进而激活Caspase-9，促进癌细胞凋亡〔14，15〕。本实验显示Trx-1的表达量降低以后，凋亡相关蛋白Casepase-3、Caspase-9的表达量升高，也表明硒多糖可能是通过调节Trx-1的表达诱导HepG2细胞发生凋亡反应，从而抑制HepG2细胞的生长。