基于网络药理学探讨柴胡三参汤治疗缺血性心律失常的作用机制

冉俊宁，冯君，黄巍，唐聪聪，刘慧慧，王伟松，刘建和*

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007)

心律失常是心脏起搏和传导功能紊乱而发生的心脏节律、频率或激动顺序异常[1]。研究表明，约有90%急性心肌梗死的患者出现不同程度的心律失常，而急性心肌梗死的发病率随着老龄化、生活习惯改变、社会心理等诸多因素的影响呈现逐年上升的趋势[2-3]。缺血性心律失常(ischemic arrhythmias,IA)是冠心病比较常见的并发症，是心源性猝死发生的重要原因，发病率高，严重威胁着人类的健康[4-5]。

网络药理学以系统生物学、药物生物化学及多向药理学为理论基础，通过构建药物、靶点、通路、疾病的相互网络来探讨药物的作用机制[6-7]。中药治疗疾病具有多活性成分、多靶点、整体调节的特点，将网络药理学运用于中药作用机制的研究，有利于了解中药治病的整体性和系统性[8]。

缺血性心律失常属于中医“心悸”的范畴，基本病机为少阳不和,治法主要为和解定悸[9]。柴胡三参汤是导师刘建和教授其师在小柴胡汤基础上加减而来的，全方合用共奏和解定悸、清心活血、益气化痰之功效，临床运用于缺血性心律失常的治疗，疗效显著[10]，其机制可能是柴胡三参汤多靶点、多通路共同作用的结果。

1 材料与方法

1.1 柴胡三参汤活性成分筛选

中药系统药理学数据库与分析平台[11](Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)是一种独特的中草药系统药理学平台，它能捕捉药物、靶标和疾病之间的关系。本研究通过在TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)平台分别输入柴胡三参汤中柴胡、黄芩、半夏、丹参、苦参、党参、青蒿、甘草8味药物检索其活性成分，并对活性成分进行筛选，筛选标准为：口服利用度(OB)>30%，药物相似性(DL)>0.18[12]。将同时满足OB>30%、DL>0.18的活性成分筛选出来，作为候选活性成分。

1.2 活性成分靶点的预测

将候选的活性成分的名称输入PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库平台，获得各活性成分的化学结构式，无法在PubChem获得化学结构式的活性成分则剔除，分别将各活性成分的化学结构式输入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库进行靶点预测，即可得到各活性成分的靶点信息，无法在Swiss Target Prediction预测到的活性成分也剔除，整理所获得的靶点，删除重复的靶点[13-14]。

1.3 缺血性心律失常疾病靶标的收集

通过GeneCards[15](https://www.genecards.org/)数据库对缺血性心律失常的英文名称ischemic arrhythmias进行检索,即可得到缺血性心律失常的靶点信息，将靶点信息导入Excel2016进行处理，设定筛选标准为Relevance score>10,即可得到缺血性心律失常的疾病靶标。

1.4 共同靶点筛选

利用在线作图平台(http://bioinfo.genotoul.fr/jvenn/example.html)将柴胡三参汤活性成分的靶点与缺血性心律失常疾病靶点进行映射构建韦恩图，分别以CHSS、IA表示柴胡三参汤、缺血性心律失常，得到共同靶点，这些靶点可能是柴胡三参汤治疗缺血性心律失常的关键靶点。

1.5 构建蛋白互作网络

将获得的共同靶点导入STRING[16](https://string-db.org/)数据库，选择Multiple proteins，限定物种为Homo sapiens，进行共同靶基因间的蛋白互作网络分析，各蛋白相互作用的信息在数据库中以置信度分值表示，置信度0.4以上表示有互作关系，故设定置信度为中等(medium confidence>0.4)，其他参数不变，获得蛋白互作网络(PPI，protein-protein interaction)。并将node1、node2、Combined score 值导出，运用Cytoscape3.7.1软件得到各靶点的degree值，将其导出在Excel2016绘制簇状条形图。

1.6 共同靶点GO功能注释和KEGG富集分析

运用Cytoscape3.7.1软件中的插件ClueGo[17]对筛选出的共同靶基因进行GO生物学功能注释，对共同靶点进行富集分析，保留P≤0.05的结果，并对图形进行可视化处理，分析柴胡三参汤治疗缺血性心律失常可能的生物过程。同时将共同的靶点文件导入DAVID[18](https://david.ncifcrf.gov/)进行KEGG通路富集分析，设定筛选筛选条件为P<0.05、Count=2，得到分析结果,将KEGG通路富集分析结果导出在Excel2016进行数据处理，并绘制KEGG通路簇状条形图，然后将处理好的数据在imageGP[19](http://www.ehbio.com)在线平台上进行分析，作出KEGG通路富集气泡图。

2 结果

2.1 柴胡三参汤活性成分信息

该研究在TCMSP平台，运用筛选标准，共得到活性成分311种，删除重复活性成分27种、在PubChem未搜索到化学结构式及在Swiss Target Prediction未预测到靶点的活性成分69种后，得到柴胡三参汤八味中药215种活性成分，其中半夏12种、柴胡14种、丹参38种、党参13种、甘草74种、黄芩27种、苦参26种、青蒿11种。

2.2 活性成分靶点预测

将215种柴胡三参汤的活性成分在PubChem获得化学结构式，并在Swiss Target Prediction进行靶点预测，共得到靶点23 884个，去重后得到柴胡三参汤活性成分相关靶点1 319个。

2.3 缺血性心律失常疾病靶点的获得

在GeneCards数据库平台对缺血性心律失常(ischemic arrhythmias)的疾病靶点进行检索，运用筛选标准后，共获得120个相关靶标。

2.4 共同靶点的获取

将缺血性心律失常的120个疾病相关靶点与柴胡三参汤活性成分的1 319个靶点输入在线作图平台绘制韦恩图(图1)，其中IA代表缺血性心律失常，CHSS代表柴胡三参汤，两类靶点取交集后即可的到疾病-活性成分共同靶点43个，此即是柴胡三参汤治疗缺血性心律失常有重要意义的靶点。

图1 缺血性心律失常靶点与柴胡三参汤成分靶点韦恩图

2.5 蛋白互作网络的构建及核心靶点的筛选

运用STRING数据平台分析输入的43个共同靶点后得到蛋白互作网络(PPI)，共获得相互作用节点43个和相互作用关系370条，具体见图2。并将STRING数据平台中得到的结果node1、node2、Combined score 值导出，运用Cytoscape3.7.1软件计算出每个靶点的degree，将结果导出到Excel2016，将degree值的前20绘制成簇状条形图(图3)，通过degree值测算出柴胡三参汤治疗缺血性心律失常的重要靶标，分别为白蛋白(ALB)、白细胞介素-6(IL6)、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1)、一氧化氮合成酶3(NOS3)、肿瘤坏死因子(TNF)、血管紧张素1转化酶(ACE)、Serpin家族E成员1(SERPINE1)、激肽原1(KNG1)等。

2.6 共同靶点GO生物功能注释

运用Cytoscape3.7.1软件中的插件ClueGo对缺血性心律失常与柴胡三参汤活性成分的43个共同靶点进行GO生物功能注释，保留P<0.05的结果，进行可视化的处理，得到GO富集分析的网络图(图略)和饼状图(图4)，网络图中生物过程不同表示的颜色深浅不同，节点大小表示调控强弱，节点间连线表示相互作用。由图可知共同靶点主要富集于活性氧代谢过程的积极调节(positive regulation of reactive oxygen species metabolic process)、调节血液凝固(regulation of blood coagulation)、调节血管直径(regulation of blood vessel diameter)、调节血液循环(regulation of blood circulation)、一氧化氮生物合成过程的积极调节(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)等221个生物过程。表明柴胡三参汤主要通过调节活性氧代谢过程、血液凝固、血管直径等生物过程来治疗缺血性心律失常。

图2 共同靶点蛋白互作网络

图3 degree值前20的共同靶点簇状条形图

图4 共同靶点GO生物功能注释饼状图

2.7 共同靶点KEGG通路富集分析

运用DAVID对43个共同靶点进行KEGG通路富集分析，通过筛选标准，将分析结果导出到Excel2016进行数据的处理，绘制KEGG通路富集簇状条形图(图5)，其中X轴表示neglog10Pvalue值，Y轴表示通路的名称。然后在imageGP 在线平台对Excel2016处理过的KEGG通路富集分析的数据进行分析，得到KEGG通路富集气泡图(图6)，其中气泡大小取决于Count值，颜色深浅取决于Pvalue值，X轴为关联基因数与信号通路上总基因数的比值(Gene Ratio)，Y轴为通路名称。由图可知，共同靶点主要富集在补体和凝血级联信号通路、肥厚性心肌病信号通路、Toll样受体信号通路、细胞凋亡信号通路、扩张型心肌病信号通路、癌症信号通路等14个信号通路。

图5 KEGG通路富集簇状条形图

图6 KEGG通路富集气泡图

3 讨论

柴胡三参汤具有和解少阳、养心定悸之功效，缺血性心律失常属于中医“心悸”的范畴，病机主要为少阳不和，故柴胡三参汤能够在临床有效的治疗缺血性心律失常[20]。现代医学的研究表明，柴胡具有抗炎、降血脂、解热、抗肿瘤等作用[21-22]，黄芩有降压、抗心律失常、抗炎、抗肿瘤、保肝等作用[23-25]，半夏具有抗炎、抗肿瘤、止呕等作用[26]，丹参具有抗动脉粥样硬化、抑制心肌肥厚、抗心肌缺血、抗心肌纤维化、抗心律失常等作用[27-28]，苦参具有抗心律失常、利尿、抗炎、调节免疫和神经等作用[29]，党参具有心血管保护、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等作用[30-31]，青蒿具有抗疟、抗炎、免疫调节、抗肿瘤等作用[32]，甘草具有降血脂、抗炎、免疫调节等作用[33]。尽管柴胡三参汤的各个药物的现代药理研究已经较为明确，但是其治疗缺血性心律失常的机制还尚不完全明确。

本研究通过degree值测算出柴胡三参汤治疗缺血性心律失常的前8个重要靶标，分别为ALB、IL-6、AKT1、NOS3、TNF、ACE、SERPINE1、KNG1。ALB可影响营养代谢、组织液分布和底物转运，调节氧化还原电位、血浆胶体渗透压，并介导对自由基和其他有害化学物质的保护[34]。IL-6在免疫、组织再生和新陈代谢中均起作用，它的快速产生有助于宿主感染和组织损伤时的防御，但其过度合成或受体信号的失调与疾病病理有关[35]。AKT，又称蛋白激酶B(PKB)，它可调节必需的细胞功能，如迁移、增殖、分化、凋亡和代谢等，并可影响各种促血管生成因子和抗血管生成因子的表达或活性，已经提出Akt同种型Akt1是血管生成相关异常的治疗靶标[36]。一氧化氮(NO)作为重要的血管扩张剂，在心血管稳态中起着重要的作用，其中介体是由NOS1、NOS3、NOS2等合成的，其中NOS3是心血管系统中NO形成的最重要的亚型[37]。肿瘤坏死因子是一种多效细胞因子，在各种生理和病理条件下产生不同的刺激，它对T细胞、B细胞、树突细胞发育起重要作用，同样也是炎症介质和细胞凋亡诱导剂[38]。研究表明，ACE在调节血压和电解质液体内稳态中起重要作用[39]。SERPINE1可抑制尿激酶型纤溶酶原(uPA)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)，减少纤溶酶原向活性蛋白酶纤溶酶的转化[40]。激肽原1是参与肾功能、血压、心功能及炎症调节的重要因子[41]。故柴胡三参汤主要通过对ALB、IL6、AKT1、NOS3、TNF、ACE、SERPINE1、KNG1等靶点的调节来达到治疗缺血性心律失常的作用。

富集分析的结果表明，治疗过程中主要的通路可能是钙信号通路、Toll样受体信号通路、细胞凋亡信号通路、mTOR信号通路、VEGF信号通路等[42]。其中钙信号通路[43]、Toll样受体信号通路[42,44]、细胞凋亡信号通路[45]是在缺血性心律失常中起重要作用的通路。缺血性心律失常是冠心病比较常见的并发症。研究表明，在早期激活mTOR信号通路可以促进内皮细胞的增殖和更新，并修复其损伤，mTOR信号通路还可调节脂代谢和细胞自噬，故可发挥抗冠状动脉粥样硬化性和心律失常的作用[46]。VEGF可以促进生理性或病理性血管的新生，是重要的血管生成促进因子，通过降低或抑制VEGF的表达，可以减少血管新生，从而防治动脉粥样硬化的发生发展[47]。其中mTOR信号通路与VEGF信号通路又可相互影响[48]。本研究还发现柴胡三参汤治疗缺血性心律失常主要与调节活性氧代谢过程、血液凝固、血管直径、血液循环、一氧化氮生物合成过程等生物过程相关。心肌缺血再灌注损伤可导致各种心律失常，其与自由基增多密切相关，而活性氧与一氧化氮均属于自由基，对于心肌缺血再灌注损伤防治的关键在于尽早恢复血流、清除自由基等[49]。故柴胡三参汤可能主要通过恢复心肌血流、清除自由基等机制来治疗缺血性心律失常。

综上，本研究基于网络药理学的方法，挖掘到柴胡三参汤215种活性成分及1 319个作用的靶点，缺血性心律失常疾病的靶点120个，药物与疾病的共同的靶点43个，通过degree值测算、GO及KEGG富集分析，预测到柴胡三参汤可能是通过调控ALB、IL6、AKT1、NOS3、TNF、ACE、SERPINE1、KNG1等靶点，调节钙，Toll样受体，细胞凋亡，mTOR，VEGF等信号通路，从而发挥调控细胞凋亡、抑制炎症反应、免疫调节、恢复心肌血流、清除自由基等作用来治疗缺血性心律失常。但由于各数据库数据、软件功能的限制，应以该研究结果作为基础或线索，运用实验研究来对其作用机制进行进一步的论证。