16S rRNA测序探讨岭南湿证人群肠道菌群结构变化

宋佳堉，丛梦雨，巫柳岑，王术玲

(广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

广东地处岭南，气候炎热湿温，四季长夏冬暖，吴又可《温疫论》 中曾道：“南方卑湿之地，更遇久雨淋漓，时有感湿者。”清代广东名医何梦瑶于《医碥·中湿》道：“岭南地卑土薄，土薄则阳气易泄，人居其地，腠理汗出，气多上壅。地卑则潮湿特盛，晨夕昏雾，春夏淫雨，人多中湿……。”岭南地区人们喜澡善泳，喜食生猛海鲜，长期湿闷的气候和当地的生活饮食习俗影响着人们的脾胃运化功能[1-2]。湿邪绵绵久客体内，易困脾胃，遂成湿证体[3-4]。尤其每年三、四月份阴雨绵绵，湿证症状最为明显，起床难，没精神，身困体乏，纳呆，四肢酸沉，大便粘滞不成形，舌苔白厚、黄腻、边有齿痕[5]。广东人习用具有祛湿、健脾、降火、清热等功效的中药煲汤或煮凉茶以缓解症状，调理湿证体质，比如葛根鲫鱼汤、木棉花糖水等。根据中医理论，湿证病因重在脾胃，胃肠道功能是湿证的主要病机[6]，大便溏薄或泻泄是湿证体质的重要表现，而大便形状与肠道菌有直接关系，因此推测湿证体质人群的肠道菌群结构可能存在一定的破坏[7]，故本文通过招募志愿者，利用16S rRNA扩增子测序[8-9]，研究湿证体质人群的肠道菌群组成。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究采用问卷调查的方式，于2018年3月—2018年4月召集志愿者53名，性别不限，年龄19～25岁，BMI 19～26 kg/m2。志愿者经广州中医药大学黎同明、高洁两位教授的诊断并结合调查问卷的内容，分成健康对照组和湿证组。湿证人群的纳入标准：主证为大便溏而不爽，身重肢倦[1,10]。正常对照组应无上述症状及其他任何不适。排除标准：近3个月内使用过抗生素；近1个月内服用过益生菌制剂(包括酸奶)；患有消化道疾病。经过诊断，符合标准者共29名，湿证组(简称M组)16名和正常组(简称C组)13名。本研究符合世界卫生组织《涉及人的生物医学研究国际伦理准则》和世界医学协会最新修订的《赫尔辛基宣言》的相关规定。

1.2 粪便样本的收集

志愿者按日常习惯排便后，立刻收集于冷冻保藏管中，置于医用冰盒运回实验室，放入-80℃冰箱待制样送检。收回样本29个，其中编号为C7、C9、M4、M8、M9、M11、M13的志愿者采样时操作不规范，故弃去，共剩余有效样本22个。

1.3 样品检测与库的建立

提取粪便样本总DNA，使用Qubit法对样品浓度进行精确定量检测，合格后需建立文库，构建目的扩增子(Amplicon)片段并回收。使用融合引物建库方法，合成融合了目标序列引物和上机接头、index等序列的引物，通过一步PCR扩增直接完成建库，使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化并溶于Elution Buffer。样品的合格检测，总DNA提取质控，修饰末端融合引物并PCR扩增，测序文库构建及 Illumina Miseq 平台高通量测序由深圳华大基因科技服务有限公司进行。

1.4 数据分析

利用Illumina Miseq平台对肠道菌群DNA进行高通量测序；上机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data方可用于后期分析；通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags；在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释；基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。通过Alpha Diversity(α多样性分析)，Beta Diversity(β多样性分析)，等数据分析手段，最终得到粪便菌群的物种丰度信息。

2 结果

2.1 样本测序数据分析

本项目入选的研究样本共22个，其中对照组(Control)和湿证组各11个样本。高通量焦磷酸测序共产生1 374 547条有效序列，其中对照组11个样本获得688 061条有效序列(平均每个样品序列数为62 551±421)；11个湿证组样本共获得686 486条有效序列(平均每个样品序列数为62 408±396)。[11]通过分析不同样本OTU组成(97%相似性),可以反映样本的差异和距离。如果两个样品距离越近，则表示这两个样品的组成越相似、差异越小。不同处理或不同环境间的样本可能表现出分散和聚集的分布情况，从而可以判断相同条件的样本组成是否具有相似性。图1为基于OTU丰度的PLS-DA 分析，可看出湿证组和对照组的组成差异较大。

图1 基于OTU丰度的PLS-DA 分析图

2.2 肠道微生物 α多样性分析——微生物群落结构分析

利用独立样本t检验(双侧)对所有样本有效序列的群落丰富度指数(species richness)和群落多样性指数(species diversity)进行比较分析[12]，包括：Observed species、ace、 Chao、Shannon和Simpson等5个指数。如表1所示，反映群落丰富度的Observed species，ace和Chao指数在湿证组显著性高于对照组(P<0.05)；而反映群落多样性的Shannon和Simpson指数在湿证组与对照组相比无差异。以上结果提示，湿证组比正常对照组的肠道菌群群落丰富度发生了显著变化。

表1 湿证组和健康对照组α多样性参数比较

注：*P<0.05，有统计学意义

2.3 肠道微生物 β 多样性分析

β多样性分析(β diversity)是用来比较物种多样性方面存在的差异大小，本文采用unweighted UniFrac指数衡量β多样性，利用该指数得到的分析图中距离越大表示样本间的差异越大。如图2中的主坐标分析PCoA图所示，除个别样本存在偏差，湿证组和健康对照组基本呈现在不同区域。

图2 β多样性分析(物种多样性)

2.4 门水平肠道菌群序列分类分析

肠道菌群大多数序列隶属于Firmicutes(厚壁菌门)及Bacteroidetes(拟杆菌门)，这两种菌门序列大约占总序列数90%以上，是肠道菌群中的绝对优势菌群。本研究中，在门水平上，湿证组与健康对照组之间，肠道菌群物种丰度较高的拟杆菌门(Bacteroidetes，49.94% vs 45.09%)、厚壁菌门(Firmicutes，42.16% vs 45.75%)、变形菌门(Proteobacteria，6.87% vs 6.76%)、蓝藻菌门(Cyanobacteria，0.12% vs 0.05%)、软壁菌门(Tenericutes，0.04% vs 0.02%)、放线菌门(Actinobacteria，0.70% vs 1.10%)均未见显著性差异。而与对照组相比，差异最明显的是梭杆菌门(Fusobacteria，0.12% vs 0.89%) 湿证组降低了86.5%(P<0.05)。见图3。

图3 门水平物种差异图

2.5 科水平肠道菌群物种组成分类分析

在科水平上，与对照组相比，差异最明显的是普雷沃菌科(Paraprevotellaceae，2.08% vs 0.03%)，湿证组升高了近70倍(P<0.05)；此外，韦荣球菌科(Erysipelotrichaceae，0.25% vs 0.95%)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae，0.56% vs 1.04%)，湿证组分别下降了73.95%、46.34%(P<0.05)。见图4。

2.6 属水平肠道菌群物种组成分类分析

湿证组与对照组相比共有6个属差异显著，分别是梭杆菌属(Fusobacterium，0.07% vs 1.13 %)，双歧杆菌属(Bifidobacterium，0.56 % vs 1.04 %)，湿证组分别降低了93.76%、46.40%(P<0.05)；萨特氏菌属(Sutterella，1.39% vs 0.82%)，颤螺旋菌属(Oscillospira，1.01 % vs 0.64 %)，粪球菌属(Coprococcus，1.93% vs 0.70 %)，丁酸亚胺菌属(Butyricimonas，0.22% vs 0.07%)，湿证组分别升高了69.08%、58.19%、176.59%、200.78%(P<0.05)。见图5。

图4 科水平物种差异图

图5 属水平物种差异图

2.7 种水平上肠道菌群组成分析

与对照组相比，湿证组中的产蛋白酶嗜热细菌(Anoxybacillus kestanbolensis)丰度显著降低(P<0.05)；而口腔毛绒厌氧杆菌菌(Lachnoanaerobaculum orale)、婴儿链球菌菌(Streptococcus infantis)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、产黑普氏菌(Prevotella melaninogenica)、淡黄奈瑟氏菌(Neisseria subflava)、牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis)、粘滑罗氏菌(Rothia mucilaginosa)、龄齿罗氏菌(Rothia dentocariosa)在湿证组的丰度显著升高(P<0.05)。见图6。

图6 种水平物种差异图

2.8 PICRUSt肠道菌群功能预测分析

利用PICRUSt软件对16S测序样本中可能存在的各级KEGG通路及丰度值进行预测，共富集到81个功能通路[13]，其中湿证组有9条通路相对于正常对照组差异显著(P<0.05)，见图7，分别是：半胱氨酸和甲硫氨酸代谢(cysteine and mathionine metabolism)，能量代谢(energy metabolism)，叶酸生物合成(folate biosynthesis)，半乳糖代谢(galactose metabolism)，甘油磷脂代谢(glycerophospholipid metabolism)，脂多糖生物合成蛋白(lipopolysaccharide biosynthesis proteins)，氮代谢(nitrogen metabolism)，氧化磷酸化作用(oxidative phosphorylation)，五磷酸途径(pentose phosphate pathway)。说明湿证体质引起的各种不适(如大便不爽，四肢酸沉等)可能与这些通路的功能异常有关。

图7 差异通路图

3 讨论

本文对比了湿证体质志愿者与健康对照志愿者的肠道菌群组成，发现整体指标上，湿证组的群落丰富度指数与健康对照组显著不同，而群落多样性指数没有差异，提示湿证组的肠道菌群中没有形成新的菌种，只是有些细菌分布比例发生显著改变。具体表现为湿证组的梭杆菌门(Fusobacteria)、韦荣球菌科(Erysipelotrichaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)显著降低，普雷沃菌科(Paraprevotellaceae)显著升高；另外，还发现湿证组有6个属、9个种的细菌分布与健康对照组显著不同。此外我们利用PICRUSt软件预测到这些肠道菌群的改变能引起11个通路的功能改变，提示这些功能的改变可能是湿质体质症状表现的诱因。

老火靓汤和凉茶是广东最有特色的两张名片，是千百年来人类与大自然抗 争的结果，利用一些药食同源的中药材调理人体以适应环境、气候等对健康的影响。历来中医古籍记载岭南多疫瘴疠气，这与湿温的气候导致空气中微生物分布相比北方要多有关[14]。岭南湿热蕴蒸的气候特点使长久生活于此的居民容易形成湿证体质，最常见的表现之一就是大便粘滞不爽，本文通过对湿证体质人群的肠道菌进行基因测序，发现与健康对照组相比，湿证组的肠道菌群结构存在显著差异。而广东人习用的煲汤药材或凉茶或许是通过调节肠道微生态而改善湿证的症状[15]，这些推测仍需更深入的研究。