糖尿病大鼠中医证候表征的演变

赵瑛,王婕,杨明艳,王冬雪,郇帅

(哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076)

近年来，采用中医药防治糖尿病的研究逐渐成为热点，而动物糖尿病中医证候模型的建立是制约其发展的关键性因素[1]。证候是疾病发展不同阶段病理生理的概括，有动态性、阶段性、个体性等特征，故建立动物中医证候模型时应引入时间的观点，动态观察模型动物整个疾病发生发展的过程[2]。因此本实验通过连续10周全面、动态的监测糖尿病大鼠外观体征和证候相关实验室指标的变化，对糖尿病发展过程中证候特点进行归纳阐述，寻找符合糖尿病发展过程的中医证候模型，旨在为预防与治疗糖尿病提供基础。

1 实验材料

1.1 实验动物

雄性Wistar大鼠97只，6～8周龄，体质量(220±10)g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，SPF级，许可证号：SCXK(吉)-2016-0003，合格证号：201700016425。室温控制在(23±2)℃，实验动物采用通气笼饲养，每笼4只，实验期间可自由摄食饮水。

1.2 实验试剂

STZ(Sigma公司)；大鼠葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)；大鼠环磷酸腺苷(cAMP)试剂盒、大鼠环磷酸鸟苷(cGMP)试剂盒、大鼠皮质醇试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；游离三碘甲腺原氨酸(FT3)放射免疫分析试剂盒、游离四碘甲腺原氨酸(FT4)放射免疫分析试剂盒(北方生物科技有限公司)。

1.3 实验设备

FA1004分析天平(上海越平科学仪器有限公司)，GLM-76血糖仪(厚美德生物技术有限公司)，S8独立通气笼(苏杭科技器材有限公司)，RT-6000酶标分析仪(RAYTO公司)，旷场箱及其软件(淮北正华生物仪器设备有限公司)。

2 实验方法

2.1 实验动物分组及造模

大鼠适应性喂养7 d，按体质量随机分为对照组(n=16)和模型组(n=81)。实验动物禁食不禁水12 h，模型组大鼠腹腔注射65 mg·kg-1链脲佐菌素(STZ)，对照组注射等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。造模72 h(0 w)后，采用葡萄糖氧化酶法测空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol·L-1的大鼠纳入模型组。成模后第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w用血糖仪测定空腹血糖，血糖恢复的动物剔除。

2.2 中医外观体征的观察

成模第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w称量各组大鼠体质量，进行代谢笼测定大鼠12 h食量、水量、尿量，观察粪便色泽形状。动态观察实验动物的外观体征：毛色毛态(柔顺、枯黄、无光泽、竖立、脱毛)，精神状态(正常、萎靡)，行为状态(正常、少动、眯眼、拱背)等。对各组大鼠的舌、爪、鼻进行拍照及图像处理，采用Photoshop 7.0图像软件，选取舌、爪、鼻特定区域定量提取色度R、G、B，进而求出反映红色程度的C值，C=R/(R+G+B)。

2.3 动物自主活动能力考察

成模第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w测定各组大鼠自主活动能力。实验于规格为100 cm×100 cm×40 cm旷场箱内进行。实验前将所有的大鼠单独放在旷场箱内自由活动5 min，每天2次，连续2 d，以减轻大鼠对新环境的焦虑。测试时间为5 min。使用软件记录正式实验被测大鼠5 min总路程和平均速度。

2.4 实验室指标的测定

成模第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w，对各组大鼠禁食不禁水12 h，进行眼底静脉丛采血，采用ELLSA法测定血浆中cAMP、cGMP和皮质醇含量，采用放射免疫法测定血浆中FT3和FT4含量。

2.5 中医证候表征指标体系

依据中医证候外观体征及实验室相关指标表征中医证候的相关研究，建立中医证候表征指标体系。内热偏盛：食量、饮水量增加、自主活动增多、大便干结、舌红；气虚：精神状态萎靡、自主活动减少；阴虚：体质量降低、毛色枯黄无光泽、便干、饮水量增加、舌红、cAMP/cGMP增加；阳虚：尿量增多、大便不调、眯眼、拱背、爪和鼻色淡、FT3和FT4含量降低、皮质醇含量增加。

2.6 统计学分析

3 实验结果

3.1 空腹血糖的动态变化

本次实验以造模72 h(0 w)空腹血糖≥16.7 mmol·L-1为标准，有63只大鼠成模，成模率为77.8%。DM大鼠血糖成模后第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w显著高于对照组(P<0.01)，且各周之间无显著性差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠空腹血糖(FBG)水平比较

注：与对照组相比，**P<0.01

表2 大鼠不同阶段阶段食量、饮水量、尿量

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01

3.2 动物外观体征变化

DM大鼠在成模第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w食量、饮水量、尿量均显著高于对照组(P<0.05)，且DM大鼠成模第0 w饮水量最多，第3 w后开始回落并趋于稳定，见表2。DM大鼠体质量在造模后第0 w到10 w显著低于对照组(P<0.01)，结果见表3。

对照组外观体征从始至终均无明显变化。DM大鼠成模第1 w出现拱背和少动迟缓的症状，并持续增加；第2 w少部分出现眯眼现象，但无明显增多趋势；第3 w开始出现精神萎靡、毛色枯黄无光泽、毛态竖立、大便干燥呈黑色；第4 w开始出现脱毛现象；第5 w所有DM大鼠均出现大便干稀不调呈黄色和精神萎靡的症状。

表3 各组大鼠不同阶段体质量

注：与对照组相比，**P<0.01

与对照组相比，DM大鼠成模第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w鼻色红色程度C值均显著降低(P<0.01)；与自身0 w比较，DM大鼠5 w和10 w鼻色红色程度C值显著降低(P<0.05)。DM大鼠在成模10 w舌色红色程度C值显著低于对照组(P<0.01)。在成模各周，对照组与DM组大鼠爪色红色程度C值均无显著差异(P>0.05)，结果见表4。

表4 鼻色、舌色和爪色红色程度C值分析

注：与对照组相比，**P<0.01；与0 w相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与3 w相比，●●P<0.01；与4 w相比，△△P<0.01

3.3 动物自主活动能力变化

与对照组相比，DM大鼠5 min运动路程和平均速度在成模第0 w、3 w、4 w、5 w、10 w均显著降低(P<0.01)；与自身0 w相比，DM大鼠DM大鼠5 min运动路程和平均速度在成模第4 w、5 w、10 w显著降低(P<0.05)，见表5。表明DM大鼠成模在0 w自主活动能力开始明显降低，且持续至实验结束。

表5 各组大鼠5 min运动路程和运动平均速度

注：与对照组相比，**P<0.01；与0 w相比▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.4 实验室指标的变化

与对照组相比，DM大鼠在成模第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w血浆FT3和FT4浓度显著性降低(P<0.05)；与自身0 w相比，DM大鼠第5 w开始血浆FT3和FT4浓度显著性降低(P<0.05)。与对照组相比，DM大鼠在成模4 w、5 w、10 w皮质醇浓度均明显升高(P<0.01)，见表6。

两组大鼠的cAMP和cGMP浓度均无显著性差异(P>0.05)；与对照组相比，DM大鼠成模第3 w、4 w、5 w、10 w的cAMP/cGMP显著性升高(P<0.01)，与自身3 w相比，DM大鼠成模第4 w、5 w、10 w的cAMP/cGMP显著性升高(P<0.01)，见表7。

表6 各组大鼠血浆FT3、FT4和皮质醇浓度变化

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与0 w相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与3 w相比，●P<0.05，●●P<0.01；与4 w相比，△P<0.05，△△P<0.01

表7 各组大鼠血浆cAMP、cGMP浓度和cAMP/cGMP比值变化

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与0 w相比，▲▲P<0.01；与3 w相比，●●P<0.01；与4 w相比，△△P<0.01；与5 w相比，##P<0.01

3.5 中医证候表征变化

根据上述实验数据分析归类，糖尿病大鼠在造模0 w符合内热偏盛的证候特点，兼有阳气不足的表现持续至实验结束；3 w符合内热偏盛、阴虚、气虚的证候特点；4 w符合阴虚、气虚、阳虚的证候特点；5 w符合阴虚、气虚、阳虚的证候特点；10 w符合阴虚、阳虚的证候特点。见表8。

表8 各时间点糖尿大鼠证候表征特点

4 讨论

辨证施治是中医学的重要特点之一。而目前很多疾病的中医药防治研究及某一治则的实验研究都是建立在疾病动物模型的基础上开展的，完全脱离了辨证论治的基本思想。究其原因，很重要的一点就是目前缺乏与之相适应的中医证的动物模型，且目前已有的一些中医证或病证结合模型多是通过物理、化学、机械等因素诱导下模拟，与生物体自身或在某种疾病状态下的自然演变差异较大[3]。鉴于此本文采用经典的STZ诱导建立大鼠1型DM模型，构建中医外观体征结合中医证候相关实验室指标共表征的方法，通过描述1型DM大鼠中医证候的经时自然演变过程，已期为中医证候模型的研究提供一种思路，并为DM的中医药辨证用药研究提供一种方便可行的证候模型。

糖尿病在中医范畴属“消渴病”，燥热偏盛-气阴两虚-阴阳两虚是其基本病机及演变规律[4]。按照相同相似病理原则，临床四诊信息可以体现在大鼠动物模型上。通过观察糖尿病大鼠的形体、毛色毛态、二便情况、自主活动能力、精神状况和鼻舌爪的颜色等外观体征，推测实验动物的基本生命状态、营养情况、气血的盛衰等情况，进而判断糖尿病大鼠证候特点[5]。临床上糖尿病患者容易发生甲状腺功能异常，尤其易发生甲状腺功能减退[6]。FT3和FT4作为“下丘脑-垂体-靶腺轴”终端产物，由甲状腺分泌，其含量变化可反映甲状腺轴功能，且肾阳虚的病机学中甲减起很重要的作用[7-8]，推测FT3和FT4可能作为表征阳虚证型的一项指标。cAMP，cGMP作为第二信使，是整体性调节机制影响细胞功能的中间枢纽[9]。1986年美国生物学家Hynie认为cAMP与cGMP是体内两种对立的调节系统，可能是中医阴阳理论的物质基础[10]。有研究表明[11]，血浆cAMP、cGMP含量的改变与阴虚、阳虚证密切相关，即阴虚cAMP占优势，阳虚cGMP占优势。皮质醇是糖皮质激素的主要成分，是对糖类代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素。研究发现[12]，DM肾病患者出现“阳虚”证与肾上腺皮质激素有着密切的关系。

本实验结果显示，在成模10 w内，模型组大鼠除个别血糖会出现波动，总体维持高血糖(血糖≥16.7 mmol·L-1)、多饮、多食、多尿和体重减少的状态，可以看出本实验所建立的糖尿病模型比较稳定。DM大鼠在成模0w即出现自主活动能力、鼻色红色程度C值、血浆FT3和FT4含量显著下降的现象，且持续至实验结束，符合阳气不足的证候特点。糖尿病大鼠成模即表现出阳气不足的现象未见文献报导，故推测其原因是采用一次性大剂量注射STZ造模损伤机体阳气。

本实验DM大鼠在成模0 w食量和饮水量较对照组显著升高，符合内热偏盛的证候特点，糖尿病大鼠在成模0 w以内热偏盛为主，兼有阳气不足。DM大鼠在成模3 w出现毛色枯黄无光泽，血浆cAMP/cGMP较对照组显著升高，符合阴虚的证候特点；出现精神萎靡的现象符合气虚的证候特点；出现大便干结符合内热偏盛的证候特点，综合分析糖尿病大鼠在成模3 w开始由内热偏盛向气阴两虚过渡发展。在成模4 w自主活动能力较自身0 w比较显著降低，符合气虚的证候特点；血浆皮质醇含量显著升高，符合阳虚的证候特点，综合分析糖尿病大鼠在成模3 w以气阴两虚为主，兼有阳虚证型。DM大鼠在成模5 w 出现均精神萎靡的现象，符合气虚的证候特点；DM大鼠均出现大便干稀不调，且与自身0 w比较，鼻色红色程度C值和血浆FT4含量显著降低，与自身4 w比较，血浆皮质醇含量显著上升，表明阳虚的证候特点加重，综合分析糖尿病大鼠在成模5 w在气阴两虚基础上阳虚的证候特点的加重。在前面基础上，在成模10 w血浆cAMP/cGMP较自身3 w显著升高，符合阴虚的证候特点，综合分析糖尿病大鼠在成模10 w表现为阴阳两虚。

以65 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素所建立的糖尿病大鼠10 w内模型稳定；早期以内热偏盛为主，STZ可损伤机体阳气，故兼有轻度阳虚表现，且贯穿始终。3～5 w出现气阴两虚的表现，10 w表现为阴阳两虚。