脑缺血急性期神经血管单元的变化及三七干预作用研究

梁萍 黄清 农立宇 林军 蒙兰青

缺血性脑卒中是临床常见病，约占全球死亡总数的11%，且由于人们生活习惯、饮食、作息时间的不规律，缺血性脑卒中愈益年轻化，严重威胁人们的身体健康[1]。随着医学水平的不断提高，人们发现具有多重药理作用的三七在治疗脑缺血再灌注损伤（ischemic/reperfusion，I/R）中发挥重要作用。三七是五加科人参属草本植物，含有人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1和三七皂苷R1 等活性成分，可通过抑制细胞内钙超载、清除自由基、抗炎、保护血脑屏障及抑制细胞凋亡等作用于缺血性脑卒中病理过程多个环节，协同促进脑缺血后神经血管单元（neurovascular unit，NVU）的修复，从而减轻脑缺血损伤[2]。但目前尚无三七整体活性物质用于脑I/R损伤的治疗方法。本研究中，我们通过制作脑I/R损伤大鼠模型，观察大鼠神经行为学表现、脑梗死体积百分比、NVU 超微结构变化，探讨脑I/R 后NVU 的变化及三七干预对大鼠的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠70只，体重（250± 30）g，购自湖南省长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号为SCXK（湘）2014-0011。实验过程严格执行《中国实验动物使用和管理办法》。

1.2 药品与主要试剂三七粉（批号：160922，文山市苗乡三七实业有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（批号：20180604，北京索莱宝生物科技有限公司）；水合氯醛（批号：2015031101，成都市科龙化工试剂厂）；多聚甲醛（批号：20180730，北京索莱宝生物科技有限公司）；无水乙醇、丙酮（国药集团化学试剂有限公司）；812 包埋剂（批号：90529-77-4，SPI公司）。

1.3 仪器Leica UC7型超薄切片机（Leica公司）；Ultra 45°型钻石切片刀（Daitome公司）；HT7700型透射电子显微镜（HITACHI公司）。

1.4 方法

1.4.1 分组 SPF级SD 雄性大鼠随机分为假手术组、对照组、三七组。假手术组、对照组均分为干预前、干预后亚组；三七组又分为低（50mg/kg）、中（100mg/kg）和高剂量组（150mg/kg）。每个小组大鼠10只。

1.4.2 脑缺血损伤模型的制备 对照组和三七组大鼠参考Zea Longa 制作大鼠局灶性大脑中动脉缺血模型[3]：SD 雄性大鼠在造模前喂养10d，术前12h禁饲料、4h 禁水，10%水合氯醛（0.0035ml/g）腹腔麻醉大鼠，备皮消毒，颈部正中作一切口，逐层分离皮下筋膜、肌肉、右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉；结扎右侧颈总动脉近心端、颈外动脉近心端，夹闭右侧颈总动脉远心端；在右侧颈总动脉结扎与夹闭之间剪开一小口，并将一根直径0.235mm、长4.8cm、头部圆钝的线栓缓慢送入右侧颈内动脉，深度为18～19mm；缝合线系紧线栓，消毒、缝合切口。缺血2h 后缓慢拔出线栓约1cm，剪去皮外多余线栓，完成脑缺血再灌注损伤制备。假手术组线栓插入颈内动脉深度为8～10mm，未造成脑缺血。各组大鼠Zea Longa 5级神经功能行为学评分为0分或者4 分者均用同批次大鼠及时补足10只。

1.4.3 干预措施 三七组3个亚组大鼠在脑缺血再灌注2h 后分别按大鼠体重取用三七粉（50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg），并用生理盐水稀释配成终浓度为5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml 的溶液灌胃，之后每天2次；对照组干预后亚组、假手术组干预后亚组大鼠在相同的时间点给予等量生理盐水灌胃。其余大鼠不做处理。术后干预7d。

1.4.4 神经功能行为学评分 再灌注7d 时根据Zea Longa评分标准对大鼠进行神经功能行为学评分。

1.4.5 TTC染色测定大鼠脑梗死体积百分比 7d 后对大鼠进行腹腔麻醉、断头取脑，快速清除表面血迹，去除嗅球、小脑、低位脑干；先后经过冷冻、冠状位切片、染色等步骤后予生理盐水终止染色，4%多聚甲醛固定；24h 后拍照；采用Image-Pro Plus 6.0图片分析软件计算脑梗死体积百分比。

1.4.6 透射电镜观察脑细胞超微结构的变化 干预7d 后，进行腹腔麻醉、心脏放血、断头取脑，将裁剪脑组织置入电镜液固定，1%锇酸·0.1M 磷酸缓冲液固定，先后经过酒精、丙酮脱水，丙酮、812 包埋剂渗透，包埋，切片，染色后在透射电镜下观察、分析。

1.5 统计学分析采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析，计量资料采用±s表示，各组数据在满足正态分布和方差齐性时，组间采用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q 检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠I/R损伤模型的建立三七组、对照组大鼠造模成功表现为病灶对侧前肢不能完全伸直，或行走时向病灶对侧转圈或倾倒。

2.2 各组大鼠再灌注后Zea Longa 神经功能行为学评分比较干预7d 后评分显示，假手术组干预前后神经功能缺损评分均为0；对照组干预前后神经功能评分比较差异无统计学意义（P＞0.05）；三七组大鼠神经功能缺损评分逐渐改善，明显低于同一时间点对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；三七中、高剂量组与低剂量组相比，差异均有统计学意义（P＜0.01），但中、高剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠再灌注后神经功能行为学评分比较（±s，n=10）

表1 各组大鼠再灌注后神经功能行为学评分比较（±s，n=10）

注：与同时间点对照组干预后比较，▲P＜0.01；与同时间点50mg/kg剂量组比较，#P＜0.01

时间 假手术组 对照组 三七组干预前 干预后 干预前 干预后 50mg/kg 100mg/kg 150mg/kg再灌注2h 0 0 2.10±0.32 1.90±0.58 1.89±0.60 1.90±0.58 1.60±0.52干预7d 0 0 1.30±0.26 1.25±0.26 0.90±0.21▲ 0.65±0.24▲# 0.50±0.00▲#

2.3 各组大鼠脑梗死体积变化比较假手术组干预前后均未见梗死灶，其他各组均有不同程度的梗死灶形成。对照组干预前平均脑梗死体积百分比为41.68%，干预后平均脑梗死体积百分比为39.72%，与假手术组相比差异有统计学意义（P＜0.01），但组内比较差异无统计学意义（P＞0.05）；三七低、中、高剂量组平均脑梗死体积百分比分别为25.67%、15.07%、8.36%，与对照组干预后相比，脑梗死体积百分比降低，且呈剂量依赖关系，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 各组大鼠NVU超微结构变化比较

2.4.1 各组大鼠神经元电镜下形态学变化 假手术组神经元细胞核核膜清晰，染色质分布均匀，电子密度低，线粒体有轻微扩张，线粒体嵴尚清晰，粗面内质网轻微扩张。对照组干预前亚组神经元周围水肿严重、成片状空白溶解区；细胞膜破裂，细胞器流失；细胞核皱缩，染色质分布尚均匀；线粒体中度肿胀，结构模糊，大部分细胞器溶解破坏。对照组干预后亚组细胞核尚完整、核膜尚清晰，但核内常染色质减少，异染色质增多，大部分线粒体嵴断裂消失，呈空泡样改变，胞质内溶酶体数量明显增多，内质网轻微扩张，结构模糊，高尔基体数目减少。三七低剂量组神经元细胞核核膜较为清晰，染色质分布均匀；线粒体有明显肿胀扩张，部分嵴消失、断裂，呈空泡化改变；粗面内质网轻微扩张（同高尔基体），部分结构破坏，有核糖体脱失。三七中剂量组核膜较为清晰，细胞核分裂，团块状核仁边集，线粒体、粗面内质网轻微扩张，细胞状态较低剂量组好。三七高剂量组细胞核核膜清晰，细胞核分裂，染色质分布均匀，电子密度低，线粒体、粗面内质网结构轻微扩张。见图1。

图1 各组大鼠神经元电镜下超微结构图（×2500）

2.4.2 各组大鼠星形胶质细胞电镜下形态学变化 假手术组星形胶质细胞胞核大，椭圆形，核膜清晰完整，细胞核稍皱缩，染色质轻微碎裂，边集；细胞膜结构完整；胞质内细胞器丰富，线粒体轻微扩张，嵴清晰可见，粗面内质网结构轻微疏松扩张。对照组干预前亚组星形胶质细胞明显呈水肿、空泡化改变，细胞核呈异形改变，核内空洞形成，线粒体明显肿胀、空泡化，高尔基体重度肿胀扩张（板层结构消失），粗面内质网扩张，出现大量内质网空泡。对照组干预后亚组星形胶质细胞整体状态不佳，水肿现象严重；核皱缩明显，核膜结构不清晰，核染色质轻微碎裂、边集；细胞膜断裂，细胞器流失，线粒体重度肿胀扩张，嵴消失，呈空泡化改变，内质网轻微扩张，高尔基体明显肿胀，结构紊乱。三七低剂量组星形胶质细胞周围水肿，细胞核轻度皱缩，线粒体重度扩张（损伤程度大于中、高剂量组），大部分线粒体嵴断裂消失并呈空泡化改变，高尔基体重度扩张（板层结构消失），粗面内质网扩张并出现内质网空泡（与中、高剂量组相似），见1个自噬溶酶体。三七中剂量组星形胶质细胞周围明显呈水肿、空泡化改变；细胞外形不规则，胞核皱缩，细胞核呈异形改变；线粒体有中度肿胀扩张，嵴消失，呈空泡化改变，高尔基体肿胀扩张（板层结构尚存），粗面内质网扩张，出现大量内质网空泡，水肿损伤程度轻于低剂量组。三七高剂量组星形胶质细胞周围轻度水肿、空泡化改变，细胞核呈异形改变，线粒体有中度肿胀扩张，嵴消失，部分呈空泡化改变，高尔基体中度肿胀扩张，粗面内质网扩张，出现中等量内质网空泡。见图2。

2.4.3 各组大鼠脑微血管内皮细胞电镜下形态学变化 假手术组微血管内皮细胞周围无水肿，致密间隙无扩大，基底膜连续，管腔基本正常，细胞核无明显皱缩，线粒体轻微肿胀。对照组干预前亚组微血管内皮细胞周围水肿严重，可见空泡状或空白区，紧密连接破坏，通透性增加，管腔尚可。对照组干预后亚组微血管内皮细胞变形明显，周围结构溶解、水肿严重，核固缩，管腔重度狭窄，线粒体轻度肿胀，结构模糊。三七低剂量组微血管内皮细胞周围无明显水肿现象，基底膜尚连续，胞核不规则改变，管腔中度狭窄，线粒体结构模糊。三七中剂量组细胞外形较低剂量组规则，周围无水肿，致密间隙无扩大，基底膜连续、薄厚均匀，胞核固缩，管腔轻度狭窄，线粒体结构模糊。三七高剂量组微血管内皮细胞周围轻度水肿，但细胞变形不明显，管腔基本通畅，线粒体结构正常，嵴清晰。见图3。

图2 各组大鼠星形胶质细胞电镜下超微结构图（×2500）

图3 各组大鼠脑微血管内皮细胞电镜下超微结构图（×2500）

3 讨论

神经元是中枢系统信息接收、传递的关键[4]；星形胶质细胞释放的神经营养因子是神经元存活、血管再生介质的基础，是脑缺血损伤后神经保护和神经调节的极好备用资源[5]；血管系统为脑细胞输送氧气和营养物质，共同形成的血脑屏障是NVU 发挥作用的一个重要结构。脑缺血再灌注损伤后脑微血管内皮细胞受损，进一步导致的血管痉挛加剧脑缺血所致的缺血缺氧损伤。脑缺血后的逐层放大效应可逐渐累及毛细血管周边的星形胶质细胞，继而凋亡的星形胶质细胞会产生细胞毒性杀死邻近的神经元。脑I/R损伤是缺血性脑卒中重要的发生过程，兴奋性毒性损伤、氧化应激、细胞凋亡等过程贯穿了缺血性脑卒中病理过程各个环节，最终导致不可逆的脑细胞凋亡[6]。凋亡过程涉及神经元、星形胶质细胞、微血管内皮细胞及基质成分；神经血管单元作为脑I/R损伤的整体治疗模型强调了整体保护的重要性[7]。

研究证实，三七治疗脑缺血损伤疗效显著。人参皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1 配伍具有协同抗脑缺血损伤作用，显著对抗脑I/R 急性期的能量代谢障碍[8]。三七皂苷R1 通过抑制钙离子内质网流出通道—IP3 活化，以对抗因钙离子过度释放引起的脑血栓形成[9]。三七多糖可能通过抑制脑缺血后脂质过氧化反应和炎症反应有效缓解脑缺血损伤[10]。脑缺血损伤发生后，三七成分之一的人参皂苷加速神经干细胞的增殖，并向神经元、星形胶质细胞分化[11]。三七三醇皂苷能够促进血管再生和侧枝循环的建立，增加缺血区周边脑血液供应，减小脑梗死体积[12]。人参皂苷Rg1 通过抑制Caspase-3 的表达明显减少细胞凋亡等[13]。三七以其多途径、多靶点的药理作用特点促进NVU 的修复，对于脑缺血再灌注损伤治疗过程至关重要。

我们利用线栓法制作脑缺血损伤大鼠模型，缺血2h、再灌注7d，从大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积百分比、细胞超微结构方面研究三七的治疗效果。结果显示，三七可通过减小大鼠脑梗死体积及减轻NVU 超微结构损伤，改善大鼠神经功能行为。然而，目前关于三七对脑I/R损伤的神经保护作用只是初步的认识，其具体机制尚有待进一步探讨。本课题组既往已证实三七可通过增加NVU 组分神经元、胶质细胞和血管内皮细胞神经元核抗原蛋白、胶质纤维酸性蛋白、层黏连蛋白表达，多靶点促进神经血管单元修复，明显改善神经血管单元的超微结构[14]，今后将继续深入研究三七如何多途径作用于脑I/R损伤。