LncRNA XIST通过调控miR-186-5p促进非小细胞肺癌的增殖和侵袭实验研究*

才 昊，韩 亮，李晓飞

锦州医科大学附属第三医院胸外科(锦州 121000)

肺癌是常见的呼吸系统肿瘤，也是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤，占肿瘤死因第一位，其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是其常见病理类型，占全部肺癌的80%[1]。目前，肺癌发病因尚未完全明确，认为与吸烟、环境污染、肺部慢性感染及遗传等因素有关。然其发病隐匿，早期临床特征及表现不典型，致其早期确诊率低下，大多患者就诊时已发生转移，整体预后不佳。因此对肺癌发生发展的分子机制进行深入研究与探讨，对肺癌的临床治疗及改善患者预后具有重要意义。长链非编码RNA(LncRNAs)是长度超过200个核苷酸序列且不编码蛋白质的非编码RNA，其在多种细胞水平均可通过复杂分子机制进行基因表达调控[2]，但其机制特点尚不明确。最新研究[3]表明，LncRNA作为调节因子几乎参与全部细胞过程，在肿瘤的发生发展中发挥着促癌或抑癌作用。并有研究[4]表明，LncRNA可以促进肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭，可作为评判肿瘤细胞生物学行为及预后的预测标志。LncRNA XIST是XIST基因产物，位于人染色体Xq13.2，参与调控X染色体失活[5]。研究[6-7]证实XIST是具有生物学功能的LncRNA，在乳腺癌、卵巢癌、人鼻咽癌等肿瘤中均高表达。且最近研究指出，XIST与NSCLC患者预后密切相关[8]。然有关XIST在NSCLC发生发展中的作用机制尚未阐明且未见太多研究报道。因此，本研究就LncRNA XIST调控NSCLC发生发展的作用机制进行了探究，以期为临床治疗提供新的方向和思路。

材料与方法

1 材料及仪器 本研究所用非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549、H1299、Calu-3及人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)均购自中科院上海细胞库。试剂及仪器：RT-PCR逆转录试剂盒购自美国HyClone公司；胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM细胞培养基购自美国GIBCO公司；MTT试剂、BCA蛋白质定量试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；XIST siRNA由上海吉玛制药技术公司合成；RIPA裂解液购自美国Santa Cruz公司；PCNA、CCND1、Bcl-2、MMP-9抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司；miR-186-5p模拟/抑制物、XIST表达载体均购自广州锐博生物科技有限公司；荧光定量PCR 扩增仪购自美国ABI 公司等。

2 细胞培养 研究所用NSCLC细胞系A549、H1299、Calu-3培养于DEME培养基，人支气管上皮细胞系BEAS-2B培养于PRMI1640培养基，37 ℃、5% CO2培养箱恒温培养，待细胞生长达到80%～90%时取出培养皿，加入含0.03%浓度EDTA的胰蛋白酶进行细胞消化传代培养3次后行细胞冻存处理。

3 LncRNA XIST与miR生物信息学分析 通过检索生物信息学数据库和DIANA数据库预测可能与LncRNA XIST结合的miRNA，取两者检测交集同时结合NSCLC现有miRNA研究信息，筛选出与XIST存在结合位点的 miR-186-5p。

4 引物设计及表达载体构建 利用生物信息学数据库和Primer5.引物设计软件以GAPDH及U6为内参进行LncRNA XIST、XIST干扰序列siRNA和miR-186-5p引物的检测设计，并构建包含miR-186-5p识别位点在内的野生型(pmir GLO-XIST-Wt)和突变型(pmir GLO-XIST-Mut)XIST片段荧光酶素报告基因载体。引物序列见表1。

表1 基因引物序列

5 XIST siRNA转染 于12孔培养皿中接种适量NSCLC细胞，1 ml DNEM+10%FBS培养待细胞汇合率达到30%～50%，1.5 ml无菌EP管加入100 μl无血清培养基，后分别加入终浓度为100 nmol/L的XIST siRNA和5 μl Lipofectamine 2000，混匀静置20 min，再加入RNA-脂质体复合物正常培养6～8 h后换为新鲜培养基培养48 h。RT-PCR验证其转染效率。

6 miR-186-5p mimic及inhibitor转染 构建miR-186-5p mimic及inhibitor表达载体，同上接种、培养细胞至30%～50%汇合率，无菌EP管加入100 μl无血清培养基，分别加入终浓度为100 nmol/L的miR-186-5p mimic或inhibitor和5μl Lipofectamine 2000，混匀静置20 min再加入RNA-脂质体复合物，后续培养方式同上。

7 RT-PCR 采用Trizol法并参照其反应试剂盒说明书提取各细胞总RNA，利用紫色分光光度计测定OD260/280吸收值及RNA纯度。按逆转录试剂盒说明书及其反应体系分别加入总RNA及LncRNA XIST或miR-186-5p的逆转录RT引物，逆转录获取其cDNA；后根据荧光定量反应试剂盒及其反应体系将所得cDNA进行PCR扩增，反应条件：LncRNA XIST：95 ℃(60 s)、95 ℃(15 s)、60 ℃(60 s)、72 ℃(30 s)，循环40次；miR-186-5p：94 ℃(10 min)、94 ℃(15 s)、69 ℃(60 s)、72 ℃(30 s)，循环40次，实验均重复3次。采用2-△△Ct法定量分析各细胞系中LncRNAXIST或miR-186-5p相对表达量。选取转染效率较明显的两组细胞进行后续实验。

8 MTT实验检测细胞活性 待NSCLC细胞系成功转染XIST siRNA 48 h后分别取生长状态良好的对数生长期细胞制成单细胞悬液，2×103/孔接种于96孔板，每组设8个平行孔。于转染培养后24 h、48 h、72 h取出培养板，每孔加入20 μl MTT液继续培养4 h，吸除上清液，加入150 μl二甲基亚砜振荡溶解，酶联免疫检测仪于570 nm 波长检测各细胞光密度值。

9 Transwell实验检测细胞侵袭 -20 ℃冰箱中取出Matrigel基质胶室温过夜液化稀释为工作液，加入Transwell小室底部膜上室，37 ℃培养箱培养30 min胶化Matrigel；无血清培养液培养细胞12 h后制成细胞悬液，于Transwell培养板上室加入100 μl细胞悬液和200 μl无血清培养基，下室加入600 μl RPMI 1640培养液，37 ℃、5% CO2条件培养24 h；取出小室，95%酒精固定，结晶紫溶液染色；随机选取三个视野于高倍镜下观察细胞数量，取其平均值。

10 Western blot检测细胞增殖侵袭相关蛋白含量 收集成功转染XIST siRNA后的NSCLC细胞系，利用RIPA裂解液进行裂解提取总蛋白，后采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定提取蛋白浓度；采用转印蛋白及免疫检测于电泳结束前进行转膜处理，后将PVDF膜放入BSA 室温封闭 2 h，TBST 洗膜 3次，加入TBST稀释的PCNA孵育过夜；利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗室温孵育 2 h；膜于化学发光检测试剂反应2 min，取膜，包好PVDF膜，于暗室中行X 胶片感光、显影、定影。

11 荧光酶素报告实验 转染前一天按2×104个/孔浓度接种于 24 孔板，含10% FBS 的DMEM 高糖培养基培养，待细胞汇合度至50%～60%时加入300 μl OPTI-MEM 培养基及用其稀释的1 μl Lipofectamine 2000，终体积50 μl，静止5 min，加入20 μmol/L的miRNA 1 μl和荧光素酶报告基因质粒0.1 μg及转染复合物液于37 ℃、5% CO2培养箱孵育转染48 h， PLB裂解收集裂解液至发光板，加入LAR Ⅱ 工作液及Stop & Glo Reagent，混匀，分别读值2 s，保存数据。

12 RIP实验 预冷PBS液清洗NSCLC细胞系2次，加入RIP Lysis Buffer置于冰上裂解并收集产物-80 ℃保存；后制备重悬磁珠，加入5 μl AgO2/IgG 抗体孵育去上清，RIP Wash Buffe 清洗 2 次；每管磁珠AgO2/IgG 抗体混合物中加入RIP Immunoprecipitation Buffer，裂解、离心，取上清至磁珠-抗体管中行RNA 结合蛋白-RNA 复合物免疫沉淀及RNA纯化。

13 营救实验 分别构建miR-control、miR-186-5p mimics、XIST表达载体及miR-186-5p mimics + XIST表达载体转染至A549细胞系，分别设为control组、miR-186-5p组、XIST组及miR-186-5p + XIST组；接种于12孔培养皿培养至细胞汇合率达50%，1.5 ml离心管加入100 mmol/L miR-186-5p、100 μl 无血清培养基和(或)2 μg 表达载体质粒及4 μl Lipofectamine 2000混匀，加入脂质体复合物，37℃、5% CO2孵育箱培养。待转染48 h后分别取对数生长期细胞制成悬液，分别进行MTT、Transwell实验，实验步骤同上。

结 果

1 NSCLC细胞系中LncRNA XIST表达情况 采用RT-PCR法以BEAS-2B细胞系为对照，对NSCLC细胞系A549、H1299、Calu-3中LncRNA XIST表达水平进行检测，结果显示：NSCLC细胞系中LncRNA XIST表达水平均显著高于人支气管上皮细胞系BEAS-2B(P<0.05,图1)。

图1 NSCLC细胞系中LncRNA XIST表达水平

2 转染XIST siRNA后NSCLC细胞中XIST和miR-186-5p表达情况 选取表达相对较高的NSCLC细胞系A549、H1299转染XIST siRNA敲降其LncRNA XIST表达，以si-NC组作为阴性对照。RT-PCR检测显示：与si-NC组相比，敲降XIST后A549、H1299细胞中LncRNA XIST表达显著降低，miR-186-5p表达显著增高，两组比较差异有统计学意义(P<0.05,图2)。

注：两组比较，*P<0.05

3 转染miR-186-5p mimic及inhibitor后NSCLC细胞系中XIST表达情况 分别转染miR-186-5p mimic及 inhibitor至A549、H1299细胞系，采用RT-PCR检测转染后A549、H1299细胞中XIST表达情况，以空白Control组作为对照。结果显示：转染miR-186-5p mimic后A549、H1299细胞中XIST表达显著降低，而转染miR-186-5p inhibitor后A549、H1299细胞中XIST表达显著升高，比较差异有统计学意义(P<0.05),提示过表达miR-186-5p可显著降低NSCLC细胞中XIST表达(图3)。

4 敲降XIST抑制NSCLC细胞增殖活性 转染敲降A549、H1299细胞中XIST表达，以si-NC组作为阴性对照。采用MTT法分别于转染24 h、48 h、72 h,利用酶联免疫检测仪检测各组细胞光密度值。结果显示：转染48 h、72 h 时，A549、H1299细胞的si-XIST组OD值显著低于si-NC组，比较差异有统计学意义(P<0.001)，提示敲降XIST抑制NSCLC细胞增殖能力(图4)。

注：三组比较，*P<0.05

5 敲降XIST抑制NSCLC细胞侵袭能力 转染敲降A549、H1299细胞中XIST表达，以si-NC组作为阴性对照。采用Transwell实验检测A549、H1299细胞侵袭能力。结果显示：敲降XIST表达后，A549、H1299细胞平均每视野穿过细胞数较si-NC组明显减少，比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示敲降XIST抑制NSCLC细胞侵袭能力(图5)。

注：两组比较，*P<0.05

6 敲降XIST抑制NSCLC细胞增殖侵袭相关蛋白表达 采用Western blot实验检测转染敲降XIST对A549、H1299细胞增殖、侵袭相关蛋白CCND1、PCNA、MMP-9及Bcl-2表达的影响，以内参蛋白β-actin为对照。结果显示：敲降XIST表达后，A549、H1299细胞中CCND1、PCNA、MMP-9、Bcl-2蛋白表达水平较内参蛋白β-actin表达降低(图6)。

图6 敲降XIST后CCND1、PCNA、MMP-9、Bcl-2蛋白表达降低

7 XIST与miR-186-5p结合验证 通过检索生物信息学数据库和DIANA数据库筛选出与LncRNA XIST存在结合位点的miR-186-5p,并构建包含miR-186-5p识别位点在内的pmir GLO-XIST-Wt和pmir GLO-XIST-Mut荧光酶素报告基因载体。为进一步验证两者之间的调控关系，研究以miR-NC为对照，将miR-186-5p mimic分别转染至NSCLC细胞系A549、H1299中，并同时转染pmir GLO-XIST-Wt和pmir GLO-XIST-Mut报告质粒载体。采用荧光酶素报告基因实验检测各组细胞荧光霉素活性，结果显示：共转染miR-186-5p mimic和pmir GLO-XIST-Wt可使A549、H1299细胞荧光酶素活性降低(P<0.05)，而共转染miR-186-5p mimic和pmir GLO-XIST-Mut则不能引起报告载体荧光素酶活性改变，提示XIST是miR-186-5p的靶向基因(图7)。

注：两组比较，*P<0.05

8 miR-186-5p调控 XIST 采用RIP实验(RNA结合蛋白免疫共沉淀实验)检测XIST和miR-186-5p是否存在于相同RISC复合体，沉淀在A549、H1299细胞中包含miRNA及与其结合的LcnRNA的内源性Ago2蛋白。RT-PCR检测Ago2蛋白和IgG蛋白中XIST和miR-186-5p表达水平，结果显示：A549、H1299细胞中XIST和miR-186-5p在Ago2免疫沉淀复合物中的表达含量显著高于IgG免疫沉淀复合物(P<0.05)，提示miR-186-5p以Ago2依赖的方式调控XIST(图8)。

注：三组比较，*P<0.05

9 miR-186-5p抑制XIST促进细胞的增殖作用选取A549细胞为例分别转染miR-control、miR-186-5p mimics、XIST 表达载体和miR-186-5p mimics+XIST 表达载体，培养72 h。采用MTT法检测各组细胞生长情况，结果显示：与Control组相比，XIST组OD值明显增高，miR-186-5p组OD值明显降低，miR-186-5p+XIST组OD值低于Control组，高于miR-186-5p组。提示过表达miR-186-5p显著抑制A549细胞活性，抑制过表达XIST促进A549细胞的增殖作用(图9)。

10 miR-186-5p抑制XIST促进细胞的侵袭作用 转染A549细胞，采用Transwell实验检测各组细胞侵袭能力，结果显示：与Control组相比，XIST组每视野细胞数明显增加，miR-186-5p组每视野细胞数明显减少，miR-186-5p+XIST组每视野细胞数少于XIST组，多于miR-186-5p组。提示过表达miR-186-5p显著降低A549细胞侵袭能力，抑制过表达XIST促进A549细胞的侵袭作用(图10)。

注：四组比较，*P<0.05

注：四组比较，*P<0.05

讨 论

近年来随着人类对基因的研究及基因组测序技术的发展，已证实大多数基因组可转录为RNA，仅1%～2%可以编码蛋白质，因此可将全部RNA分为蛋白质编码RNA和蛋白质非编码RNA(ncRNA)[9]。目前人类对于长链非编码RNA(LncRNAs)的研究相对较少，但目前研究[10]已经证实LncRNAs其结构特异性和碱基特异性可通过与核酸或蛋白质相互作用，对基因表达能力进行调节。据了解，人类基因组几乎都可转录 LncRNA，其与编码基因相比有着不同的转录方向[11]。最近研究[12-13]证实LncRNA扮演着干扰转录、调节蛋白活性、诱导染色体重塑、改变细胞或蛋白结构等细胞调节功能，可通过与蛋白质结合、转录调控、RNA剪接及表观遗传调控等分子机制在癌症中发挥促癌或抑癌作用，与包括恶性肿瘤在内的众多种疾病密切相关。此外，Jang等[14]研究表明，肝细胞转移癌中LncRNA ATB高表达，促进肿瘤细胞器官定植，诱导上皮至间质的侵袭。Jia等[15]研究指出，LncRNA H19异常表达在转录调控水平诱导肝癌、肺癌、乳腺癌的发生发展，且可降低人脑胶质瘤细胞对替莫唑胺的耐药。而Wan等[4]研究发现在表观遗传学上LncRNA PVT1可通过调控 LATS2的表达促进NSCLC的增殖。可见对LncRNAs在NSCLC中的分子作用机制进行研究可为其临床治疗提供新的思路。

1991年LncRNA XIST被首次研究发现，指出XIST参与X染色体灭活的启动阶段。既往研究再次证实乳腺癌、淋巴瘤、卵巢癌等众多肿瘤的发生发展与XIST相关，XIST参与细胞的全部过程，影响肿瘤的增殖和侵袭。是否可以推测LncRNA XIST在NSCLC中发挥着相同作用。因此，本研究首先采用RT-PCR法检测NSCLC细胞系及人支气管上皮细胞系中XIST表达是否差异，发现NSCLC系中XIST高表达。通过转染XIST siRNA敲降细胞系中XIST表达，检测发现各细胞系中XIST表达水平显著降低。为研究LncRNA XIST是否参与NSCLC的发生发展，研究中通过MTT实验、Transwell 实验和 Western blot实验，探究了敲降LncRNA XIST表达对NSCLC恶性生物学行为的影响,结果发现经敲降XIST表达后，NSCLC细胞增殖、侵袭能力显著降低，其细胞中增殖、侵袭相关蛋白表达含量也明显降低，研究证实敲降LncRNA XIST表达可显著抑制NSCLC的增殖及侵袭。

研究指出NSCLC中LncRNA UCA1通过靶向调控miR-193a-3p表达发挥促癌作用。miR-18a的表达可激活降低结直肠癌中LncRNA CASC2的表达。以上研究均指出LncRNAs和miRNAs间存在相互作用。为验证NSCLC中LncRNA XIST是否同样可作为ceRNA参与肿瘤细胞的发生发展，本研究利用生物信息学数据库结合NSCLC的miRNA既往研究成果，检索筛选出与LncRNA XIST存在结合位点的miR-186-5p进行探究，检测发现敲降XIST表达后，NSCLC细胞中miR-186-5p表达升高。经构建转染miR-186-5p mimic和inhibitor检测发现LncRNA XIST与miR-186-5p间存在相互抑制关系。根据LncRNA XIST与miR-186-5p可能存在的结合位点，构建包含miR-186-5p在内的XIST野生型和突变型基因报告载体，利用荧光素霉基因实验和RIP实验进一步验证两者间的调控关系和调控方式，发现NSCLC细胞中miR-186-5p直接调控XIST，XIST是miR-186-5p的靶向基因，而miR-186-5p以Ago2依赖方式调控XIST表达。营救实验进一步证实过表达miR-186-5p可逆转XIST对NSCLC细胞的增殖、侵袭作用。

综上所述，LncRNA XIST在NSCLC中高表达，LncRNA XIST通过调控 mi R-186-5p表达水平影响NSCLC细胞的增殖和侵袭，XIST可作为其临床治疗的新靶点。