大红火龙果花粉离体萌发条件的优化及其活力测定方法筛选

孙佩光，程志号，李洪立，孙长君，郭素霞，丁哲利，吴 琼*

(1.中国热带农业科学院 海口实验站/海南省香蕉遗传改良重点实验室，海南 海口 571010； 2.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所，海南 海口 570100)

火龙果〔Hylocereusundatus(Haw.)Britt. et Rose〕又名红龙果、仙蜜果、龙珠果，属仙人掌科(Cactaceae)量天尺属(Hylocereusundatus)[1]。火龙果作为一种新兴热带水果在我国的栽培历史较短，生产上的栽培品种主要来自中国台湾和越南，存在品种老化、自交不亲和、需要人工授粉等问题[2-4]。此外，火龙果在自然授粉条件下存在落花落果严重、单果重小、经济价值不高等问题。戴雪香[5]报道，火龙果单株开花量平均为15朵，在自然授粉时约有47.71%花蕾在花后脱落。异花授粉能够显著降低落花率、提高座果率和单果重、促进果实发育，并且还可以改善果肉颜色、果实品质和风味等[6-8]，而决定异花授粉成功的关键是花粉萌发率(生产中采用培养基测定的为花粉萌发率)/花粉活力(生产中采用染色法进行测定的为花粉活力)。

花粉萌发率/花粉活力低，花粉管生长缓慢将无法完成受精或授粉受精不良；花粉萌发率/花粉活力高，花粉管能够快速伸长到达子房完成授粉受精过程[9]。而花粉萌发率/花粉活力高低除与自身质量相关外，还与萌发时蔗糖、硼酸、pH、生长调节剂等环境条件密切相关[10-12]。因此，人为辅助改善火龙果花粉萌发条件以期提高其授粉受精能力至关重要。目前关于花粉萌发条件优化的报道多集中于梨[10]、桃[9]等大众果树，火龙果的相关研究较少。

花粉萌发率/花粉活力直接决定了火龙果坐果率和产量，准确测定花粉萌发率/花粉活力对于丰产栽培、杂交育种以及果实品质改良等具有重要意义。花粉萌发率的测定采用离体萌发法进行，该方法准确率高，但是耗时较长。染色法测定的花粉活力耗时短，但存在已染色但不萌发的现象。对于火龙果花粉活力的研究已有少量报道，但由于测定方法、品种差异、栽培措施和萌发条件等差异，所得的研究结果不同。胡子有等[13]用形态观察法检测红皮红肉和红皮白肉火龙果的花粉活力均在90%以上；林平等[14]采用碘-碘化钾(I2-KI)染色法和氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定红皮红肉火龙果的花粉活力为40%～70%；谢穗红等[15]利用离体萌发法测定(培养基含25%蔗糖+ 0.05%硼酸)白玉龙、珠龙火龙果和霸王花的花粉萌发率分别为61.38%、58.95%和 52.81%；王玉林等[12]使用液体培养基测定红皮红肉火龙果的花粉活力最高，为65.76%。

目前，鲜见采用离体萌发法、醋酸洋红染色法、I2-KI染色法、TTC染色法和亚历山大红染色法等多种方法对比分析火龙果花粉萌发率/花粉活力的系统报道。对影响花粉萌发条件的蔗糖浓度、硼酸浓度和培养基pH等条件进行优化，探索适宜大红火龙果花粉萌发的适宜条件和培养基组分，并在此基础上运用不同方法测定大红火龙果的花粉活力，筛选准确、快速测定火龙果花粉活力的最佳方法，以期为大红火龙果人工授粉及其丰产栽培、杂交育种以及果实品质改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

大红火龙果(Hylocereusmonacanthus)花粉采自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所实验基地。2019年9-0月于花朵开放前，选择无病虫害、生长一致的5～6朵花带回实验室水培，待到20:30-21:30花朵全部绽放时，使用毛笔轻轻扫落花粉粒于硫酸纸上，收集5～6朵花的花粉并等量混匀，用毛笔蘸取少许花粉，播撒在不同的蔗糖浓度梯度、硼酸浓度梯度和pH梯度的培养基上，28℃恒温光照培养箱中培养12 h以上。

1.2 方法

1.2.1 单因素试验设计 依次对蔗糖浓度、硼酸浓度和pH 3个因素进行筛选和优化。花粉萌发的基础培养基 (BK1) 组成为硼酸(H3BO4)100 mg/L + Ca(NO3)2·4H2O 0.3 g/L + MgSO4·7H2O 1.2 g/L + KNO30.1g/L + 1%琼脂，pH6.5，以此培养基为基础，分别进行蔗糖浓度和硼酸浓度的筛选。蔗糖梯度设置5%、10%、15%、20%、25%、30%等6个梯度，硼酸浓度设置100 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、700 mg/L、1 100 mg/L和1 300 mg/L 6个硼酸梯度；根据上述试验筛选出花粉萌发率高且有利于花粉管生长伸长的最适蔗糖浓度、硼酸浓度，并将最适宜的蔗糖浓度和硼酸浓度带入基础培养基 BK1中配置成培养基BK2，使用手持式pH计测定未调pH时的BK2培养基pH为6.7，因此pH设6.0、6.7、7.0和8.0 4个梯度。每个处理3个培养皿，每个培养皿至少观察3个视野。萌发花粉以花粉管超过花粉粒直径为萌发，花粉萌发率用以下公式计算：

1.2.2 不同染色法测定火龙果花粉生活力的比较 TTC染色法测定花粉活力参照文献[16]进行；I2-KI测定花粉活力参照文献[17]进行；醋酸洋红测定花粉活力参照文献[18]进行；亚历山大红测定花粉活力方法参照文献[19]进行。将不同测定方法的火龙果花粉活力计数，每处理观察3个载玻片，3次重复。

1.3 数据统计和分析

使用Excel 2007和SPSS 19.0对数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 不同因素对大红火龙果花粉萌发率的影响

2.1.1 蔗糖浓度 从封3图版Ⅰa～f可知不同蔗糖浓度处理的大红火龙果花粉萌发情况。从图1可知，低浓度的蔗糖对花粉萌发率的促进作用不明显。 5%浓度梯度下花粉萌发率较低，为(18.62 ± 2.31)%(封3图版Ⅰ a)。随着蔗糖浓度梯度增加，大红火龙果花粉萌发率呈现先增后减的单峰型变化；蔗糖浓度为15%时，花粉活萌发率最高，为(54.68±4.46)%，该条件下的花粉管生长较长(封3图版Ⅰ c)；高浓度蔗糖(25%)培养基上花粉管生长和伸长受到抑制，尤其是30%蔗糖浓度时表现尤为明显(封3图版Ⅰ e，f)。蔗糖浓度为15%和20%时花粉萌发率无显著差异，但二者与其他浓度蔗糖处理的花粉萌发率差异极显著，从提高花粉萌发率的角度宜选15%蔗糖浓度。

注：图中不同大小写字母表示差异极显著(P< 0.01)和显著(P< 0.05)，下同。

Note: Differentcapital and lowercase letters mean significantly different atP<0.01 andP<0.05 levels, respectively. The same below.

图1 不同蔗糖浓度处理大红火龙果的花粉萌发率

Fig.1 Pollen germination rate ofH.monacanthustreated with different sucrose concentrations

2.1.2 硼酸浓度 从图2和封3图版Ⅰg～m可知，在硼酸浓度为100 mg/L时，大红花粉萌发率较低；随着硼酸浓度梯度增加，花粉萌发率在一定程度上呈增加趋势；在硼酸浓度为700 mg/L时花粉萌发率最高，为(43.90±6.27)%。硼酸浓度为500 mg/L和700 mg/L的花粉萌发率差异显著；硼酸浓度为700 mg/L时的花粉萌发率与900 mg/L、1 100 mg/L和1 300 mg/L的花粉萌发率无显著差异。然而高浓度的硼酸容易造成大红火龙果花粉内含物外溢，且花粉管生长受抑制，较高浓度的硼酸容易引起花粉管变粗，并严重抑制花粉管伸长(封3图版Ⅰ k～m)。因此，大红火龙果离体萌发较适宜的硼酸浓度为700 mg/L。

Fig.2 Pollen germination rate ofH.monacanthustreated with different boric acid concentrations

2.1.3 培养基pH 从图3可知，培养基溶液pH为7.0时，花粉萌发率最高，为(45.77±4.82)%；而pH6.7时花粉萌发率次之，为(43.9±6.27)%；pH7.0与pH6.7的花粉萌发率无显著差异；当培养基溶液pH6.0或pH8.0时，花粉的萌发率均低于40%。pH6.7、pH7.0的花粉萌发率与pH6.0、pH8.0的花粉萌发率差异极显著。pH6.7的培养基上花粉萌发时很少发生内含物外溢现象，花粉管伸长也未受明显抑制；而pH7.0的培养基上花粉萌发时存在许多内含物溢出现象，其花粉管前部呈现螺旋状或卷曲状不生长等现象，且花粉管长度明显较短(封3图版Ⅰ o～q)。因此，从促进花粉萌发和花粉管伸长的角度，离体萌发法培养基的pH宜选择pH6.7。

Fig.3 Pollen germination rate ofH.monacanthuson medium with different pH

2.2 不同方法测定大红火龙果的花粉活力

从封3图Ⅱa～e可知不同方法测定大红火龙果的花粉染色情况/萌发情况。从图4可知，不同方法测定大红火龙果的花粉萌发率依次为离体萌发法>醋酸洋红染色法>TTC染色法>I2-KI染色法>亚历山大红染色法。离体萌发法与醋酸洋红染色法测定的花粉活力无显著差异，离体萌发法与I2-KI染色法、TTC染色法和亚历山大红染色法测定的花粉活力差异达极显著水平。因此，在同时考察火龙果花粉萌发率和花粉管生长速度时应首选离体萌发法，而准确测定其花粉活力的方法，优选醋酸洋红染色法。

注：YS为亚历山大红染色法，CS为醋酸洋红染色法，DK为I2-KI染色法，TT为TTC染色法，IV为离体萌发法。

Note: YS is Alexander red staining; CS is Carmine acetate staining; DK is I2-KI staining; TT is TTC staining; IV is in vitro germination.

图4 不同方法测定大红火龙果的花粉活力

Fig.4 Pollen viabilities ofH.monacanthusdetected by different methods

3 结论与讨论

蔗糖是花粉管细胞分裂和生化过程中主要碳源及营养物质来源；硼元素则参与了花粉管壁的形成、花粉管的囊泡运输、碳水化合物吸收以及酚类物质的代谢等一系列生理生化过程[20]。已有研究表明，含有10%蔗糖和0.01%硼酸的固体培养基有利于桃、杏花粉的萌发和花粉管的生长[9,21-22]；而梨、笃斯越桔等果树花粉萌发需要10%～15%的蔗糖和300 mg/L的硼酸[10,23]。高赛等[24]报道，‘秦冠’苹果花粉在含有20%蔗糖和0.01%硼酸的培养基上萌发率最高；甜樱桃花粉萌发较适宜的培养基含有20%的蔗糖和0.1%硼酸[25]。谢穗红等[15]报道，一些品种的火龙果和霸王花花粉在25%的蔗糖+ 500 mg/L硼酸培养基上萌发率最高；王玉林等[12]报道火龙果花粉在含有35%蔗糖 + 600 mg/L硼酸 + pH 6.7的液体培养基上萌发最好，而在含有30%蔗糖 +400 mg/L硼酸 + pH 7.5的培养基上花粉管生长最长。研究表明，大红火龙果花粉在含有15%蔗糖和700 mg/L硼酸培养基上萌发率最高，且花粉管生长较好。大红火龙果花粉萌发时对蔗糖的需求与大多数果树相似，但对硼酸的需求远高于其他果树品种。研究结果与桃[9]、‘嘎啦’苹果[26]、梨[27]等果树上研究证实高浓度的蔗糖抑制花粉萌发结论一致。可能是高浓度的蔗糖容易引起花粉原生质体质壁分离[28]，导致花粉快速失去活性而不能正常萌发。

梨[10]、苹果[26]、笃斯越桔[23]、甜樱桃[25]等果树花粉萌发较适宜的培养基pH为6.5～6.8。王玉林等[12]报道培养基pH6.5时火龙果萌发效果较好，而培养基pH7.5时对花粉管伸长具有促进作用。研究表明，在pH6.7的培养基上，最适宜大红火龙果萌发和花粉管伸长。研究结果与王玉林等[12,15]研究结果不太一致，可能与品种差异、培养基组成成分不同和花粉萌发条件不同等因素有关。

大红火龙果花粉离体萌发较适宜的培养基组成为Ca(NO3)2·4H2O 0.3 g/L + MgSO4·7H2O 1.2 g/L + KNO30.1 g/L+ 15%蔗糖+ 700 mg/L硼酸 + 1%琼脂，pH6.7。在此基础上，可通过调整蔗糖浓度、硼酸浓度和pH，得到其他品种的火龙果花粉萌发的较适宜条件。离体萌发法与醋酸洋红染色法测定的花粉活力无显著差异，而与I2-KI染色法、TTC染色法和亚历山大红染色法测定的花粉活力差异极显著。在考察大红火龙果花粉萌发率和花粉管生长情况时应首选离体萌发法，准确测定其花粉活力时优选醋酸洋红染色法。