基于SRAP技术的姜科植物遗传多样性分析

袁 琳，代亚坤，高炳淼

(海南医学院 药学院/热带转化医学教育部重点实验室/海南省热带药用植物研究开发重点实验室 海南 海口 571199)

姜科植物在全世界约有52属，1 500余种，分布于热带、亚热带地区[1]。常用的著名药材为益智、砂仁、草豆蔻和红豆蔻等，其中益智和砂仁为我国著名的四大南药[2]。姜科植物中含有挥发油、黄酮类、甾体皂苷、双苯庚烷类、萜类等多种化学成分，现代药理学表明这些活性成分具有抗氧化、强心、抗癌、抗过敏、抗高血压和提高免疫力等药理活性[3-4]。近年来，由于过度采挖，导致其正常的繁殖方式、生长环境遭到破坏，野生资源已日渐枯竭，引起了科研工作者对姜科资源研究的重视。通过对姜科资源进行遗传距离和聚类分析，可为其种质资源鉴定和遗传变异研究提供理论依据与技术支持。因此，建立姜科资源遗传多样性的有效分析方法，对制定姜科资源的保护策略具有重要的意义[5]。

随着遗传分子科学的发展，基于PCR扩增技术的各种分子标记技术已得到广泛应用[6-8]。但分子标记技术的复杂性、稳定性以及产生遗传信息的能力各不相同，均有其优缺点[5]。SRAP作为一种新型分子标记技术结合了RAPD和AFLP的优点，高效、简单、产率高、共显性强、重复性高且不受所测样品生长发育状况、外界环境等众多因素的影响[9]。该技术已成功地应用于遗传多样性研究、遗传连锁图谱和指纹图谱的构建及基因的克隆与定位[10-12]。目前，SRAP技术对姜科种质资源的遗传多样性研究力度不够。为此，以海南岛姜科植物为材料，运用SRAP技术扩增姜科植物的基因组获得指纹图谱，利用NTSYS-pc2.1和UPGMA分别分析其遗传相似系数和构建遗传聚类树图，分析姜科植物种群间的遗传多样性，以期为姜科植物资源的保护与利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品材料 11种姜科植物样品均在海南省海口市中国医学科学院药用植物研究所(海南分所)南药园圃采集(表1)。采集的新鲜姜科叶片放置在含硅胶的密封袋中，带回实验室于-80℃冰箱中保存。

表1 11种姜科植物样品的来源信息

1.1.2 试剂 DNA Marker D2000、6×DNA loading buffer和植物基因组DNA提取试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；SRAP引物，由深圳华大基因科技有限公司合成；琼脂糖(Biowest Agarose)，购自海南合辉实业有限公司；核酸染料(Goidview)，购自上海赛百盛公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器 IBM型PCR扩增仪，北京六一生物科技有限公司；HYQ-2110型微型涡旋混匀器，美国精骐有限公司；DYY-6D电泳仪电源，北京六一生物科技有限公司；核酸蛋白测定仪，德国Eppendorf公司；HH-3型恒温水浴锅，邦西仪器科技(上海)有限公司；HY-JX5L型SDS-电泳槽，北京六一生物科技有限公司；SIGMA 1-14微型离心机，德国Sigma公司；Tanon 4100凝胶成像系统，上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 采用植物基因组DNA提取试剂盒(Plant DNA Mini Kits)提取，得到的DNA样品保存于-20℃，具体步骤参考文献[13]的方法进行。基因组DNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测和凝胶成像系统拍照。

1.2.2 PCR扩增及多态性分析 以姜科植物基因组DNA为模板，利用引物组合f8r1对11种姜科植物样品进行SRAP-PCR扩增。SRAP-PCR反应上游引物为sarp-f8：5′-TGA GTC CAA ACC GGA CT-3′；下游引物sarp-r1：5V-GAC TGC GTA CGA ATT AAT-3′[13]。PCR反应程序：94℃预变性3 min，第1个循环(94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸1 min)循环5次；第2个循环(94℃变性1 min，50℃复性1 min，72℃延伸1 min)循环35次，72℃延伸1 min，4℃保存[13]。具体SRAP-PCR反应体系参考文献[13]进行操作。PCR扩增产物取5μL经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。对明亮清晰的条带进行统计，根据不同样本的条带位点判断其多态性。

记录电泳图谱上条带的有无，条带清晰的记为“1”，条带模糊或缺失的记为“0”，转换成0/1矩阵。

1.3 数据分析

利用NTSYS-pc2.1计算11种姜科药用植物的遗传相似系数，并采用UPGMA进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 姜科植物基因组提取

从图1看出，姜科植物的DNA样品条带明显清晰、未见降解。核酸蛋白分析仪检测DNA样品的A260/A280为1.60～1.86，说明样品条带中RNA和蛋白质已基本剔除，DNA质量良好，可以作为后续PCR扩增的模版。

注：M：Marker ; 1～3：益智；4～6：红豆蔻；7～9：阳春砂；10～12：草豆蔻；13～15：高良姜；16～18：光叶山姜；19～21：爪哇白豆蔻；22～24：海南砂仁；25～27：阳荷；28～30：大苞闭鞘姜；31～33：皱叶山姜。

Note: M, Marker; 1-3,A.oxyphylla; 4-6,A.Willd; 7-9,A.villosum; 10-12,A.katsumadai; 13-15, A. officinarum; 16-18,A.intermedia; 19-21,A.compactum; 22-24,A.longiligular; 25-27,Z.strioatum; 28-30,C.megalobraecea; 31-33, A. rugosa.

图1 11种姜科植物基因组DNA电泳图

Fig.1 Genomic DNA electrophoresis of 11 species of Zingiberaceae

2.2 SRAP-PCR扩增及多态性

从图2可知，扩增产物片段大小在250～2 000 bp，部分条带清晰明亮，大小合适，但也有部分条带亮度较弱，不计入后期的数据统计。从表2可知，共获得条带59条，多态性条带数为59条，多态性比率均为100%。

注：M：Marker ; 1～3：益智；4～6：红豆蔻；7～9：阳春砂；10～12：草豆蔻；13～15：高良姜；16～18：光叶山姜；19～21：爪哇白豆蔻；22～24：海南砂仁；25～27：阳荷；28～30：大苞闭鞘姜；31～33：皱叶山姜。

Note: M, Marker; 1-3,A.oxyphylla; 4-6,A.Willd; 7-9,A.villosum; 10-12,A.katsumadai; 13-15, A. officinarum; 16-18,A.intermedia; 19-21,A.compactum; 22-24,A.longiligular; 25-27,Z.strioatum; 28-30,C.megalobraecea; 31-33, A. rugosa.

图2 姜科植物的多态性扩增电泳结果

Fig.2 Polymorphic amplification electrophoresis of Zingiberaceae

2.3 遗传多样性与聚类分析

从表3可知，11种姜科植物材料间的遗传相似系数在0.500 0～0.838 4，表明11种姜科植物间具有丰富的遗传多样性，草豆蔻与大苞闭鞘姜、海南砂仁与皱叶山姜、红豆蔻与光叶山姜、阳春砂与阳荷两两间遗传相似系数最大，均为0.838 4，表明其亲缘关系最近。红豆蔻与草豆蔻的相似系数仅0.500 0，从形态学上看，二者亲缘关系较近，但从相似系数上看，二者亲缘关系最远。

表2 11种姜科植物的SRAP扩增数据

Table 2 SRAP amplification data of 11 species of Zingiberaceae

编号Number品种Variety总扩增带数/条Number of total amplified bands 多态性带数/条Number of polymorphicbands多态性条带比率/%Ratio of polymorphic band1益智331002红豆蔻661003阳春砂11111004草豆蔻551005高良姜551006光叶山姜771007爪哇白豆蔻661008海南砂仁661009阳荷4410010大苞闭鞘姜2210011皱叶山姜44100

表3 11种姜科植物的遗传系数

从图3可知，在遗传相似系数0.500 0处11种姜科药用植物分为两大类，Ⅰ类包括益智、草豆蔻、大苞闭鞘姜、海南砂仁和皱叶山姜，其亲缘关系较近。Ⅰ类可划分为5个亚类，在遗传相似系数为0.591 0处，益智单独聚为一类；在遗传相似系数为0.838 4处，草豆蔻和大苞闭鞘姜分别单独聚为一类，海南砂仁和皱叶山姜分别单独聚为一类，表明其亲缘关系很近，益智与草豆蔻和大苞闭鞘姜、益智与海南砂仁和皱叶山姜亲缘关系较远。Ⅱ类包括红豆蔻、光叶山姜、高良姜、阳春砂、阳荷和爪哇白豆蔻，其亲缘关系较近。Ⅱ类可划分为6个亚类，在遗传相似系数为0.532 5处，爪哇白豆蔻单独聚为一类，在遗传相似系数为0.750 0处，高良姜单独聚为一类，在遗传相似系数为0.838 4处，红豆蔻与光叶山姜、阳春砂与阳荷分别单独聚为一类，表明其亲缘关系很近。

注：1为益智，2为红豆蔻，3为阳春砂，4为草豆蔻，5为高良姜，6为光叶山姜，7为爪哇白豆蔻，8为海南砂仁，9为阳荷，10为大苞闭鞘姜，11为皱叶山姜。

Note: 1,A.oxyphylla; 2,A.Willd; 3,A.villosum; 4,A.katsumadai; 5,A.officinarum; 6,A.intermedia; 7,A.compactum; 8,A.longiligulare; 9,Z.strioatum; 10,C.striolatum; 11,A.rugosa.

图3 11种姜科植物的UPGMA聚类

Fig.3 UPGMA clustering of 11 species of Zingiberaceae

3 结论与讨论

SRAP分子标记技术整合了RFLP、RAPD、SSR和AFLP的优点，具有操作过程简单、扩增条带清晰、结果稳定和重复性高等特点而广泛应用于铁皮石斛[14]、栀子[15]、红花[16]、野生兜兰[17]、石斛兰[18]和海南降香黄檀[19]等遗传多样性研究。SRAP分子标记技术应用于姜科植物的研究相对较少。SRAP分子标记可有效用于姜科药用植物的遗传差异分析及物种鉴别，并利用SRAP分子标记进行姜科各属内及属间分类和亲缘关系分析[20-21]。课题组前期研究优化了姜科益智的SRAP-PCR体系[13]，选择已筛选引物f8r1对姜科资源进行SRAP分子标记分析，以期从分子水平确定姜科种质资源亲缘关系，为姜科品种鉴定、品种保护提供理论依据，进而推动姜科资源更深层的开发利用。

研究结果表明，引物f8r1对姜科植物进行PCR扩增，获得了条带丰富且清晰的电泳图谱，多态率均为100%，说明SRAP分子标记技术在姜科资源的遗传多样性研究中有很高的检出率。因此，SRAP分子技术能很好的用于姜科植物物种间的遗传多样性分析[21]。UPGMA聚类分析表明，海南姜科植物资源具有丰富的遗传多样性。11种姜科植物分别为山姜属6种，豆蔻属3种，姜属和闭鞘姜属分别各1种。SRAP分子标记技术将11种姜科植物主要分为两大类，Ⅰ类可以划分为5个亚类：益智、草豆蔻、大苞闭鞘姜、海南砂仁和皱叶山姜。Ⅱ类可划分为6个亚类，爪哇白豆蔻、高良姜、红豆蔻、光叶山姜、阳春砂和阳荷。山姜属的红豆蔻、光叶山姜和高良姜亲缘关系很近，与传统分类结果一致。但山姜属的益智、草豆蔻、红豆蔻和皱叶山姜之间的亲缘关系较远，表明山姜属内姜科植物同样具有丰富的遗传多样性。豆蔻属的海南砂仁、阳春砂和爪哇白豆蔻之间的聚类结果亲缘关系较远，而阳春砂与姜属的阳荷亲缘关系较近，海南砂仁与闭鞘姜属的大苞闭鞘姜亲缘关系最近。高丽霞等[21]研究发现，采用SRAP分子标记分析姜花属植物系统分类中与传统形态学之间存在差异。

研究以引物f8r1对姜科植物进行SRAP分析，构建了姜科植物的遗传聚类图谱，并分析了其遗传多样性，结果表明，姜科植物提取的DNA条带明显清晰、未见降解、质量良好。SRAP-PCR扩增共获得条带59条，均为多态性条带，多态性比率均为100%。姜科植物的遗传相似系数为0.500 0～0.838 4，其中草豆蔻与大苞闭鞘姜、海南砂仁与皱叶山姜、红豆蔻与光叶山姜、阳春砂与阳荷两两间遗传相似系数最大，均为0.838 4，表明其亲缘关系最近。在遗传相似系数0.500 0处，11种姜科药用植物分为两大类，Ⅰ类包括益智、草豆蔻、大苞闭鞘姜、海南砂仁和皱叶山姜。Ⅱ类包括红豆蔻、光叶山姜、高良姜、阳春砂、阳荷和爪哇白豆蔻。