白斑狗鱼FOXL2基因克隆及其表达

唐 露, 胡 琼, 赵瑞阳, 李 菁, 古丽帕日·艾克拜, 张俊杰

(新疆农业大学 动物科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

白斑狗鱼(Esoxlucius)隶属鲑形目(Salmoniformes)狗鱼亚目(Esocoidei)狗鱼科(Esocidae)狗鱼属(Esox)，为冷水性肉食鱼类，自然分布于亚洲、欧洲及北美洲北部的冷水水域。在我国主要分布于新疆额尔齐斯河流域[1-2]。白斑狗鱼肉味鲜美，有很高的经济及营养价值，因此具有很大的市场价值及需求量[3]。白斑狗鱼个体大小存在明显的雌雄差异，雌鱼生长速度明显快于雄鱼，培育全雌性苗种可大大提高白斑狗鱼的养殖效益[4]。

FOXL2(ForkheadboxL2)属于叉头状转录因子超家族中的一员，最初是从眼睑下垂综合征(BPES)患者中克隆获得，其基因突变可以导致BPES综合症和卵巢早衰现象[5-7]。FOXL2基因在脊椎动物体内有明显的性别二态性，在卵巢中表达量高，参与卵巢的早期发育与分化，对卵巢发育和维持卵巢功能起主导作用，在精巢表达量很低或几乎不表达[8-12]。对罗非鱼[13]、南方鲇[14]、稀有鮈[15]、鲶鱼[16]、裂腹鱼[17]、乌鳢[18]等多种鱼类研究发现，FOXL2基因在这些鱼类中也表现为明显的二态性表达模式，而且主要在卵巢中表达。有关FOXL2基因在脊椎动物中已有初步研究，但有关白斑狗鱼FOXL2基因的研究尚未见报道。研究通过克隆的方法获得白斑狗鱼FOXL2基因序列，再通过荧光定量PCR方法检测FOXL2基因在白斑狗鱼不同组织和不同发育时期的表达情况，旨在为白斑狗鱼性别发育机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

基因克隆用鱼为白斑狗鱼1+龄的健康雌鱼，购自乌鲁木齐北园春市场，体重(590±30)g，体长(46±2) cm，已经达到排卵阶段。荧光定量PCR试验用白斑狗鱼为自育，分别于孵出后180 d[体重(245±5)g，体长(35±5)cm]和319 d[体重(410±10)g，体长(40±2)cm]取样，每个时期的雌雄鱼各取3尾，取其肌肉、头肾、肝、性腺、鳃、肠、肾、脑等组织放入冻存管，迅速投入液氮中，最后置于-80℃冰箱保存备用。

主要试剂有Trizol试剂(invitrogen)、反转录试剂盒和pMD18-T载体(TaKaRa)、荧光定量检测试剂盒(SYBR Green，天根生化科技有限公司)、大肠杆菌感受态细胞EX5α和Taq DNA 聚合酶(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取及cDNA模板制备 利用Trizol试剂提取各组织RNA，用琼脂糖凝胶电泳检验RNA的完整性，用酶标仪(TECAN, Infinite M200)检测RNA浓度及OD值。按照反转录试剂盒说明书将各组织RNA去除基因组DNA，并反转录得cDNA第1条链模板，cDNA保存于-20 ℃冰箱用于后续试验。

1.2.2FOXL2基因扩张引物设计与合成 利用NCBI基因库已有的白斑狗鱼基因序列，运用Primer Premer 5.0设计FOXL2基因克隆引物和荧光定量引物及内参基因引物，设计的引物送往生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 白斑狗鱼FOXL2 cDNA序列克隆及表达检测引物

Table 1FOXL2 cDNA sequence cloning and expression detection primers inE.lucius

引物 Primers序列(5′-3′) Sequence功能 FunctionFOXL2-FTACCAAAACCCCGAGGATGAC基因克隆FOXL2-RACCCCAACTAAGGACGGTGAC基因克隆FOXL2-QFCATTTTCAGGTGCTACGAGTG荧光定量PCRFOXL2-QRGTGGACCATCAGTGCCATT荧光定量PCRβ-actin-FTGAAATCGCCGCACTGGTT内参引物β-actin-RTCCGTGCTCGATGGGGTACT内参引物

1.2.3FOXL2基因片段扩增 以白斑狗鱼卵巢cDNA为模板，利用引物FOXL2-F与FOXL2-R对目的基因片段进行扩增，PCR反应体系50.0 μL，其中包括2.5 mM dNTP Mixture 4.0 μL、10×PCR Buffer 5.0 μL、FOXL2-F 2.0 μL、FOXL2-R 2.0 μL、TaKaRa TaqTM0.5 μL、模板cDNA 3.0 μL，用ddH2O加至体积50.0 μL。扩增程序：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，进行35个循环；最后72℃再延伸10 min。

PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，切胶回收后与pMD18-T载体拼接，连接产物转化到EX5α感受态细胞，过夜培养后挑取单菌落，加入到600 μL含氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。用引物FOXL2-F/R进行菌液PCR扩增和凝胶电泳检测，选取连接成功的菌液送生工生物工程股份有限公司测序。

1.2.4 FOXL2氨基酸序列分析 利用VECSREEN(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/)在线对测序结果查找并去除载体序列，并用DNAMAN拼接，然后ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)得白斑狗鱼FOXL2蛋白的ORF氨基酸序列，并BLAST得到具有不同同源性的17种物种FOXL2蛋白氨基酸序列。利用Clustal X对这些氨基酸序列进行同源性分析。最后利用Mega 4.0程序构建基于Neighbor-joining方法的氨基酸序列系统进化树进行亲缘关系分析。

1.2.5 白斑狗鱼FOXL2基因组织表达 以cDNA为qPCR模板，β-actin为内参基因，利用CFX96定量PCR仪进行不同时期、性别、组织的定量分析，每个发育阶段雌雄各取3个样品，每个样品进行3次重复。20 μL反应体系包括2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，正反向引物各0.6 μL，cDNA模板1 μL，反应程序为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，59℃退火30 s，39个循环，然后95℃ 1 min，60℃ 1 min，并分析60～95℃的熔解曲线，每个循环升温0.5℃。根据扩增得到Ct值，通过2-ΔCt法计算FOXL2基因的相对表达量，采用SPSS 16.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 白斑狗鱼FOXL2基因克隆与序列分析

以白斑狗鱼卵巢cDNA为模板克隆得1 483 bp的FOXL2基因序列，分析得这段序列的ORF为878 bp，编码FOXL2蛋白的全部292个氨基酸(图1)。通过氨基酸序列比对和构建系统进化树发现，白斑狗鱼FOXL2蛋白与其他物种FOXL2蛋白氨基酸具有较高的同源性，但与其他鱼类的同源性更高(图2和图3)。

2.2 FOXL2基因在白斑狗鱼各组织中的表达

实时荧光定量PCR对白斑狗鱼FOXL2基因在各组织(肌肉、头肾、肝脏、性腺、鳃、肠道、肾脏、脑)中的表达量水平检测结果(图4)显示，FOXL2基因在白斑狗鱼性腺、鳃和脑组织中均有不同程度的表达，在其他各组织中有微量表达或不表达。不同性别的白斑狗鱼性别表达量差异大，卵巢表达量最高(P<0.01)，精巢只有少量表达，卵巢表达量是精巢表达量的12倍，呈明显的性别二态性。孵出后320 d的雌鱼性腺组织(卵巢大约发育至Ⅳ期)FOXL2基因的表达量是180 d(卵巢大约发育至Ⅲ期)的1.5倍，呈上升趋势。

注：*表示终止子。

Note:* means terminator.

图1 白斑狗鱼FOXL2蛋白ORF的氨基酸序列

Fig.1 ORF amino acid sequence of FOXL2 protein inE.lucius

注：*为氨基酸序列相同，-表示用GAP获得最大同源性。用于比对的各个物种序列genebank序号：人Homosapiens(AAY21823.1)，小鼠Musmusculus(AAM21968.1)，猪Susscrofa(NP_001231594.1)，牛Bostaurus(NP_001026920.1)，山羊Caprahircus(AAM52099.1)，红原鸡Gallusgallus(AEE80502.1)，家鸽Columbalivia(PKK21606.1)，白斑狗鱼Esoxlucius(XP_010900597.1)，大西洋鲑Salmosalar(XP_014018845.1)，虹鳟鱼Oncorhynchusmykiss(NP_001117957.1)，深裂眶据雀鲷Stegastespartitu(XP_008301498.1)，蜂巢石斑鱼Epinephelusmerra(ACD62374.1)，罗非鱼OreochromisNiloticus(NP_001266707.1)，青鳉Oryziaslatipes(NP_001098358.1)，银汉鱼Odontestheshatcheri(ACL80211.1)，单丽鱼Cichlamonoculus(AFU74229.)，南极鳕Nototheniacorilceps(XP_010786142.1)。

Note:* means the sequence of amino acid is the same. - means the maximum homology is obtained by using GAP. Genebank number used for comparison of individual species:Homosapiens(AAY21823.1),Musmusculus(AAM21968.1),Susscrofa(NP_001231594.1),Bostaurus(NP_001026920.1),Caprahircus(AAM52099.1),Gallusgallus(AEE80502.1),Columbalivia(PKK21606.1),Esoxlucius(XP_010900597.1,Salmosalar(XP_014018845.1),Oncorhynchusmykiss(NP_001117957.1),Stegastespartitu(XP_008301498.1),Epinephelusmerra(ACD62374.1),OreochromisNiloticus(NP_001266707.1),Oryziaslatipes(NP_001098358.1),Odontestheshatcheri(ACL80211.1),Cichlamonoculus(AFU74229.),Nototheniacorilceps(XP_010786142.1).

图2 白斑狗鱼FOXL2与其他物种FOXL2氨基酸序列比对结果

Fig.2 Amino acid sequence alignments of FOXL2 inE.luciusand other species

注：Mu为肌肉，He为头肾，Li为肝脏，Go为性腺，Gi为鳃，In为肠道，Ki为肾脏，Br为脑；**表示组间差异极显著(P<0.01)。

Note: Mu, muscle; He, head kidney; Li, liver; Go, gonad; Gi, gill; In, intestine; Ki, kidney; Br, brain.** means significane of difference atP<0.01 level.

图4FOXL2基因在孵出后180d(a)和320d(b)雌雄白斑狗鱼8个组织中的表达量

Fig.4 Expression ofFOXL2 gene in eight tissues of male and femaleE.luciusat 180 d(a) and 320 d(b) after hatching

3 结论与讨论

克隆得到白斑狗鱼FOXL2序列长为1 483 bp，ORF为879 bp，总共编码292个氨基酸，序列比对发现FOXL2蛋白质氨基酸序列不仅与同目鱼类(大西洋鲑)同源性高，也与分类地位较远的鲈形目鱼类(如单丽鱼)具有很高的同源性，说明FOXL2蛋白氨基酸序列在不同鱼类中非常保守。从FOXL2系统进化树看出白斑狗鱼与大西洋鲑和虹鳟等鲑形目鱼类遗传距离相近且在同一分枝，说明其亲缘关系最近；而与鲈形目鱼类如单丽鱼等距离较远且在不同分枝，说明其亲缘关系较远。与鸟纲、哺乳纲反映的进化关系与传统分类学的进化地位相同。系统进化树反映的进化关系与传统分类学的进化地位相一致。

在哺乳动物和鸟类中，FOXL2都表现出明显的性别二态性，在卵巢中高表达，在精巢中微量表达[8-10]。Uda等对小鼠研究发现FOXL2基因的突变，可能会导致卵巢早衰现象[19]。最新近的研究表明，FOXL2基因可能是山羊雌性性别决定基因[20]。在多种鱼类的相关研究中，也发现该基因主要在鱼类卵巢中表达[13-15,21-22]。如FOXL2基因在罗非鱼卵巢发育早期开始表达，主要起参与性腺分化和维持卵巢功能的作用[13]。FOXL2在南方鲇性腺中的表达具有明显的性别二态性表达模式[14]。在青鳉中，FOXL2也主要在成体卵巢中表达，而在精巢中未能检测到表达[21]。在黄鳝(雌性阶段)性逆转前，FOXL2在卵巢中表达水平较高，在黄鳝卵巢发育和维持中起着关键的作用[22]。

对FOXL2基因进行实时定量PCR研究结果表明，FOXL2虽然在白斑狗鱼性腺、鳃和脑中均有一定程度表达，但在卵巢中的表达水平显著高于其余组织，尤其远远高于精巢中的表达水平，表现出明显的性别二态性，这与稀有鮈[15]、鲶鱼[16]、裂腹鱼[17]和乌鳢[18]等的研究结果相似。通过两个不同发育时期FOXL2在卵巢表达量的比对发现，FOXL2基因在卵巢发育初期到接近成熟期略微升高，后者是前者的1.5倍，由此推测在雌鱼性别发育过程中，该基因可能与卵巢的形成和卵巢功能维持有关，这与青鳉[21]和刀鲚[23]的表达趋势类似。