替普瑞酮对百草枯诱导的SH-SY5Y细胞TDP43蛋白异常聚集抑制作用的研究

(青岛大学附属医院神经内科，山东 青岛 266003)

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种致命的神经退行性疾病。其特征是运动神经元的快速进行性退化和随后的四肢肌肉萎缩，约5%～10%的ALS为家族性[1]。目前FDA批准治疗ALS的药物主要有利鲁唑(谷氨酸抑制剂)与依达拉奉，但其作用机制尚不完全清楚且疗效有限[2]。TDP43是主要定位于细胞核内的一种DNA及RNA结合蛋白，参与调节RNA转录和选择性剪接[3-4]。但在ALS中异常的TDP43蛋白游离于细胞核外，导致细胞质中的异常TDP43蛋白聚集，增加了细胞毒性[5-6]。已有证据表明清除异常TDP43蛋白已成为治疗ALS的一种有效方法[7-8]。替普瑞酮(GGA)是一种无毒的热休克诱导剂，有证据表明GGA可以有效通过血脑屏障从而对大脑和脊髓神经元发挥保护作用[9-10]。最近的研究表明，APP23转基因阿尔茨海默病模型小鼠通过灌胃GGA，不仅改善了认知功能，而且降低了脑组织中Aβ蛋白表达水平，并且抑制了Aβ斑块沉积[11]。可见GGA对神经退行性疾病具有一定的治疗潜力。百草枯(PQ)诱导SH-SY5Y细胞氧化应激损伤常用于模拟ALS疾病的发展过程[12-13]。因此，本研究利用PQ诱导SH-SY5Y细胞作为氧化应激模型，研究GGA对异常TDP43蛋白聚集的抑制作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SH-SY5Y细胞系由中国科学院上海细胞库提供。GGA为美国MCE公司产品。PQ为美国Sigma公司产品。DMEM培养基为美国Gibco公司产品。胎牛血清为美国BI公司产品。所有抗体均为美国Cell Signaling Technology公司产品。MTT试剂盒和Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒为索莱宝生物科技有限公司产品。

1.2 细胞模型的制备及细胞免疫荧光化学染色检测细胞内TDP43

SH-SY5Y细胞株培养于含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养。以1 mmol/L PQ处理培养24 h的SH-SY5Y细胞制备氧化应激模型(模型组)，以没有经任何处理的细胞为对照组，并通过细胞免疫荧光化学染色技术分别检测模型组和对照组细胞内TDP43的表达情况。染色步骤按照说明书操作。

1.3 MTT比色法检测SH-SY5Y细胞存活率

将研究分为无任何处理SH-SY5Y细胞组(A组)、以100 μmol/L的GGA处理SH-SY5Y细胞24 h组(B组)及以0、20、50、100 μmol/L的GGA处理氧化应激模型细胞24 h组(C～F组)。将各组旧培养液吸出，再每孔加入MTT 20 μL继续避光培养4 h，弃上清液，不冲洗加入DMSO 150 μL充分溶解甲瓒结晶，37 ℃孵育30 min，酶标仪测定490 nm波长处的吸光度(A)值，计算各组的细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组A值÷对照组A值)×100%。

1.4 流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞凋亡情况

将A～F组的SH-SY5Y细胞以不含EDTA的胰酶消化后，室温以1 000 r/min离心5 min，弃上清液；预冷后PBS重悬细胞，再次以1 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入Binding Buffer 100 μL重悬细胞后，加入Annexin V-FITC 5 μL混匀，室温下避光孵育15 min。上机前加入PI 10 μL进行染色，每组加入PBS 400 μL后上机检测细胞凋亡率。

1.5 免疫印迹法(Western blot)检测细胞中P62、TDP43蛋白表达水平及LC3BⅡ/Ⅰ比值

将A～F组的SH-SY5Y细胞提取蛋白以后以每孔20 μg蛋白量等质量上样，以100 g/L的SDS-PAGE凝胶电泳后转移至PDVF膜上。以体积分数0.05的脱脂奶粉室温封闭2 h后再分别加入TDP43抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。用TBST清洗PDVF膜3次，每次10 min，后用HRP标记的二抗室温孵育1 h，ECL发光剂显影。采用Image J软件对蛋白条带进行半定量分析，检测A～F组细胞的TDP43、P62蛋白表达水平及LC3BⅡ/Ⅰ比值情况。实验重复3次，取平均值。

1.6 Western blot检测3-MA阻断自噬后细胞中TDP43蛋白表达水平

将研究分为无任何处理SH-SY5Y细胞组(A组)以及以0、50、50 μmol/L的GGA处理氧化应激模型细胞24 h组(G～I组)，其中I组的细胞再以5 mmol/L的3-MA阻断自噬，自噬强度以LC3BⅡ/Ⅰ比值表示。采用Western blot检测A、G～I组细胞中TDP43蛋白的表达，并计算LC3BⅡ/Ⅰ比值情况。实验重复3次，取平均值。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 细胞免疫荧光化学染色检测细胞模型内TDP43表达情况

细胞免疫荧光化学染色以后对照组SH-SY5Y细胞中TDP43蛋白定位于细胞核内，模型组SH-SY5Y细胞中TDP43蛋白定位于细胞质中(图1)，图中红色箭头所指为SH-SY5Y细胞质内TDP43蛋白异常聚集体。

图1 SH-SY5Y细胞质内TDP43蛋白表达情况比较(免疫化学染色，100 μm)

2.2 各组SH-SY5Y细胞存活率和凋亡率比较

A～F组SH-SY5Y细胞存活率与凋亡率比较差异有显著性(F=37.57、74.10，P<0.01)；其中D、E、F组的细胞存活率和凋亡率与C组比较均有显著差异(q=4.11～14.24，P<0.01)。见表1。

2.3 各组SH-SY5Y细胞中TDP43、P62蛋白表达水平及LC3BⅡ/Ⅰ比值比较

A～F组SH-SY5Y细胞中TDP43、P62蛋白表达水平和LC3BⅡ/Ⅰ比值比较差异有显著性(F=56.68～231.50，P<0.01)；D、E、F组TDP43、P62蛋白表达水平和LC3BⅡ/Ⅰ比值与C组比较比较有显著差异(q=3.01～22.23，P<0.01)。见表1。

表1 GGA对各组细胞存活率、凋亡率、LC3BⅡ/Ⅰ比值及TDP43、P62表达的影响

2.4 3-MA阻断自噬后各组细胞中TDP43 蛋白与LC3BⅡ/Ⅰ比值情况

A、G～I组细胞中TDP43蛋白表达水平分别为0.97±0.09、1.27±0.03、0.34±0.06、0.87±0.05。A、G～I组细胞当中LC3BⅡ/Ⅰ比值分别为1.03±0.04、1.21±0.03、1.88±0.08、0.57±0.06。A、G～I组TDP43蛋白表达水平与LC3BⅡ/Ⅰ比值比较差异有显著性(F=40.40，66.68，P<0.01)；I组与H组细胞中LC3BⅡ/Ⅰ比值及TDP43蛋白表达水平比较差异均有显著性(q=16.02、6.12，P<0.01)。

3 讨 论

神经元胞质中异常TDP43蛋白聚集为ALS的关键神经病理学特征之一，异常TDP43蛋白聚集干扰神经元正常功能以及其本身具有多种毒性[14-15]，是导致运动神经元进行性丢失的主要原因[16]。近年来，一些能够减轻异常TDP43蛋白聚集的策略引起了人们广泛关注。有证据显示在GFP-TDP-43和GFP-TDP-25转染SH-SY5Y细胞中阿霉素和秋水仙素能够显著清除TDP43蛋白聚集，并认为这两种药物可能成为治疗ALS的候选用药[17]。最近研究表明，DJ-1(也称为PARK7)基因过表达能够通过抑制异常TDP43蛋白聚集，从而提高PQ诱导的SH-SY5Y细胞存活率[13]。因此抑制异常TDP-43蛋白聚集可能是治疗ALS的一种潜在治疗策略，这一观点得到了上述研究的支持。在本研究中，观察到GGA能够抑制PQ诱导SH-SY5Y细胞中异常TDP43蛋白聚集。GGA的这种作用表明该化合物可能是治疗和预防ALS的潜在候选治疗药物。

自噬是一种降解异常蛋白与受损细胞器的经典途径，是真核细胞内蛋白稳态系统的重要组成部分。在ALS患者尸检中发现，异常TDP43蛋白在神经元中无法及时降解而大量蓄积且自噬能力受到不同程度受损，因而自噬功能障碍可能是TDP43蛋白无法降解的原因之一[18]。有证据表明氟桂利嗪、甲氨蝶呤能够通过增强自噬促进异常TDP43蛋白聚集的清除，从而提高小鼠神经元、人干细胞源性神经元以及携带突变的TDP43基因的星形胶质细胞的存活[19]。最近的一项研究显示，海藻糖通过增强自噬而降低了转染突变型TDP43基因的SH-SY5Y细胞中异常TDP-43蛋白表达水平[20-21]。雷帕霉素对ALS的细胞模型和动物模型均显示出保护作用，如改善SQSTM1斑马鱼、ALS-TDP43果蝇模型和TDP43小鼠模型的疾病表型，清除异常TDP43聚集及减少神经元死亡[8]。这些研究表明，通过启动自噬清除异常TDP43蛋白是治疗ALS的一种有效策略。

GGA诱导热休克相关蛋白的表达是其胃保护作用的重要机制之一[22]。GGA通过抗凋亡和诱导HSP70表达，对脊延髓肌萎缩症[23]、帕金森病[24]等退行性疾病的动物模型均显示出改善症状的作用。然而重复灌胃GGA的APP23转基因阿尔茨海默病模型小鼠，其大脑中Aβ蛋白表达水平下降和Aβ斑块沉积减轻。在APP23转基因小鼠大脑中并没有检测到HSP70蛋白表达水平升高。该研究认为GGA可能是通过非依赖HSP70机制来达到改善效果[25]。同样在本研究中，GGA能够减轻PQ诱导的SH-SY5Y氧化应激模型细胞中异常TDP43蛋白聚集，但GGA的具体作用的机制仍不清楚。有证据表明GGA能够通过诱导保护性自噬，从而减轻脂多糖诱导的腹膜炎大鼠的腹膜炎症状[26]。因此，GGA的这种作用可能与自噬有关。本研究结果示，GGA能够在此模型中促进LC3BⅠ向LC3BⅡ的转换，同时减少异常聚集TDP43蛋白表达水平。而当利用3-MA阻断自噬以后，观察到GGA降低TDP43蛋白表达水平的能力显著减弱。这表明GGA可能通过增强自噬促进异常TDP43蛋白的降解，自噬的激活可能是GGA发挥神经保护作用的机制之一。

综上所述，本研究结果显示，GGA通过增强自噬抑制PQ诱导的SH-SY5Y氧化应激模型细胞中TDP43蛋白的异常聚集，这可能是GGA抑制异常TDP43蛋白聚集的机制之一。GGA的这种作用为其成为治疗ALS的候选药物提供了参考。