微小RNA-9-5p靶向HIC1降低乳腺癌细胞对多柔比星敏感性的研究

高 航，赵 峰，吴 衍，裴文江，钟 明，顾 岩，郭善禹，戴谦诚，张 伟

（上海交通大学医学院附属第九人民医院普外科，上海 200011）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，严重威胁生命健康。尽管乳腺癌的诊断和治疗策略有所改进，但病人的预后仍不令人满意。其中三阴性乳腺癌是最具侵袭性的亚型，治疗选择有限，预后差[1]。多柔比星是目前三阴性乳腺癌的化疗药物之一，为拓扑异构酶Ⅱ抑制剂[2]。虽然临床上使用多柔比星治疗三阴性乳腺癌，但常会出现对多柔比星敏感性降低和复发[3]。探究乳腺癌细胞对多柔比星敏感性降低的机制，对三阴性乳腺癌的治疗具有重要意义。

与正常乳腺组织相比，乳腺癌细胞中微小RNA-9-5p(miR-9-5p)的表达明显上调，并促进乳腺癌的增殖、迁移和侵袭[4]。通过生物信息学分析，miR-9-5p可能靶向肿瘤高甲基化基因1(hyperme-thylated in cancer 1,HIC1)，且影响乳腺癌细胞的生物学行为。本课题组前期研究发现用小激活RNA(small activating RNA,saRNA)恢复乳腺癌中HIC1的表达，可抑制乳腺癌细胞的克隆形成、迁移和侵袭[5]。此外还有研究表明，乳腺癌细胞对多柔比星敏感性降低可能与HIC1的下调有关[6]。本文将研究miR-9-5p影响三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对多柔比星敏感性的作用机制，探讨miR-9-5p与HIC1的关系，为乳腺癌的临床治疗提供参考。

材料与方法

一、材料

常见的三阴性乳腺癌细胞系有MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT20、HCC1937等。MDA-MB-231是典型的三阴性乳腺癌细胞系，其分化程度较差、恶性度高。本研究用人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A，购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。病毒和siRNA由吉满生物科技有限公司合成。miRNA和HIC1基因引物由锐博生物科技有限公司设计合成。双荧光素酶报告基因质粒由领科(上海)生物科技有限公司构建。双荧光素酶报告基因试剂盒购自Promega公司。DMEM购自Hyclone公司；MEGM kit购自Lonza公司。胎牛血清和0.25%Trypsi-EDTA(1×)购自Gibco公司。Lipofectamine 3000和Opti-MEM购自Invitrogen公司。嘌呤霉素购自Solarbio公司，多柔比星购自上海源叶生物科技有限公司。TRizol RNA提取试剂、反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒购自Takara公司；Cocktail蛋白酶抑制剂购自Bimake公司。RIPA裂解液购自上海翊圣生物科技有限公司，蛋白质印迹试验相关试剂购自碧云天(上海)生物技术有限公司。Anti-HIC1抗体 (ab49326)购自Abcam公司。CCK-8试剂盒和AnnexinⅤ633凋亡试剂盒购自东仁化学科技(上海)有限公司。

二、方法

(一)细胞培养与稳定表达细胞株的构建

MDA-MB-231细胞系使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，MCF-10A细胞系使用MEGM kit培养基，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。按照病毒转染说明书转染。转染6 h后将培养基换成新鲜完全培养基，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。由于慢病毒载体带有嘌呤霉素抗性基因，故在转染72 h后按2 μg/mL的浓度将嘌呤霉素加入完全培养基中，继续培养72～120 h，即可完全杀灭未成功转染的MDA-MB-231细胞，获得miR-9-5p转染稳定表达细胞株。实验共分4组，分别为miR-9-5p过表达组 (miR-9-5p组)、miR-9-5p过表达对照组(miR-9-5p NC组)、miR-9下调组 (miR-9-5p inhibitor组)、miR-9下调对照组 (miR-9-5p inhibitor NC组)。

(二)双荧光素酶报告基因系统

miR-9-5p有2种质粒，即miR-9-5p和miR-9-5p NC。HIC1有3种质粒，即野生型 HIC1、突变型HIC1和HIC1对照质粒，将以上两组质粒两两混合形成6组质粒混合物。提前将5×105个细胞接种于24孔板中，当细胞密度达70%时，将6组质粒混合物分别共转染细胞。培养48 h后，按双荧光素酶报告基因试剂盒说明书，检测细胞表达的萤火虫荧光值和海肾荧光值。将萤火虫荧光值除去对应的海肾荧光值，然后将所有数值标准化后分析对比。

(三)质粒转染小干扰RNA

转染时，将5×106个细胞接种于6孔板中。当细胞密度达到70%～80%时，按照Lipofectamine 3000转染说明书操作。转染72 h后收集细胞，检测转染效率。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染分两组，分别为HIC1下调组(siRNA HIC1组)和siRNA对照组(siRNA NC组)。

(四)RT-PCR检测miR-9-5p和HIC1表达

收集细胞，加入Trizol试剂提取RNA，按照Takara反转录试剂盒说明书，将RNA反转录为cDNA。实验以U6和GAPDH为内参，反应体系为10 μL，每个样本重复测量3次。RT-PCR引物序列如下：HIC1的上游引物为5′-AGAGTGTGCTGGGCAGACGA-3′，下游引物为 5′-CTTGGTGCGCTGGTTGTTG-3′；GAPDH 的上游引物为 5′-GAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游引物为 5′-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3′。使用Applied Biosystems软件进行分析，目的基因相对表达量使用2-ΔΔCt法。

(五)蛋白质印迹试验检测HIC1表达

收集细胞，用PBS清洗3遍。加入含Cocktail的蛋白质裂解液(1∶100)提取总蛋白。BCA蛋白定量后经SDS-PAGE分离(恒电压80 V，120 min)，电转(恒电流300 mA，60 min)。用5%脱脂牛奶封闭1 h后，4℃过夜保温一抗，常温1 h保温化学二抗。用超敏ECL化学发光法曝光条带。使用ImageJ软件分析条带。

(六)CCK-8检测细胞活性

在96孔板中接种细胞，每孔5×103个。待细胞贴壁后，用培养基将多柔比星(母液由灭菌DD水配制)按照一定的浓度梯度稀释，分别加入96孔板，每孔终体积100 μL，每组 3个复孔，24 h后测量CCK-8细胞活性。弃去培养基，将含10%胎牛血清完全培养基与CCK-8按10∶1体积配制CCK-8溶液。每孔加入110 μL CCK-8溶液，37℃反应3 h后，用酶标仪检测450 nm的OD值。细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As为实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8和多柔比星)，Ab为空白孔吸光度(不含细胞、多柔比星)，Ac为对照孔吸光度(不含多柔比星)。

(七)流式细胞仪检测细胞凋亡

由于转染病毒带有绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)，故使用AnnexinⅤ 633凋亡试剂盒。在6孔板接种细胞，每孔5×105个。待细胞贴壁后，将多柔比星按照不同浓度分别加入6孔板。恒温箱保温24 h后，按照凋亡试剂盒说明书处理细胞，使用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，使用FlowJo软件分析结果。

三、统计学处理

采用GraphPad Prism 8统计软件分析。数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、MDA-MB-231细胞与MCF-10A细胞miR-9-5p的基础表达比较

提取MDA-MB-231细胞与正常乳腺上皮MCF-10A细胞的RNA。RT-PCR结果显示，MDA-MB-231细胞相比于MCF-10A细胞，miR-9-5p的基础表达明显上调(P=0.002 4)(见图1)。

二、转染miR-9-5p后MDA-MB-231细胞miR-9-5p的表达变化

miR-9-5p慢病毒带有GFP基因。转染MDAMB-231细胞48 h后，可在荧光显微镜下观察到细胞表达GFP，表明转染成功(见图2)。

提取各组细胞的RNA。RT-PCR结果显示，转染miR-9-5p组相对于miR-9-5p NC组，miR-9-5p表达明显上调 (P＜0.000 1)。转染后miR-9-5p inhibitor组相对于miR-9-5p inhibitor NC组，miR-9-5p明显下调(P=0.003 4)(见图3)。

图1 MDA-MB-231细胞与MCF-10A细胞的基础表达比较

图2 慢病毒介导miR-9-5p转染的MDA-MB-231细胞（GFP，×100）

图3 转染后miR-9-5p表达的变化

三、上调miR-9-5p降低MDA-MB-231细胞对多柔比星的敏感性

将多柔比星按 0、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L 浓度稀释，加入不同组的细胞中。与miR-9-5p NC组相比，miR-9-5p 组加入浓度 1.0、2.0、4.0 μmol/L 后，其细胞活力显著升高 (P值分别为0.024 9、0.000 6、0.000 3)(见图4A)。不同处理组的细胞均加入1 μmol/L多柔比星，24 h后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。与miR-9-5p NC组相比，miR-9-5p组凋亡细胞数明显减少(P=0.023 0)(见图4B、C)。

图4 miR-9-5p上调降低对多柔比星的敏感性

四、下调miR-9-5p提高MDA-MB-231细胞对多柔比星的敏感性

与miR-9-5p inhibitor NC组相比，miR-9-5p inhibitor组加入浓度 0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L 后，细胞活力显著降低(P值分别为0.017 4、0.007 1、0.003 8、0.001 0)(见图5A)。与miR-9-5p inhibitor NC组相比，miR-9-5p inhibitor组凋亡细胞数明显增多 (P=0.023 5)(见图 5B、C)。

五、双荧光素酶检测miR-9-5p与HIC1的关系

提取各组细胞的RNA和蛋白质。RT-PCR结果显示，miR-9-5p组相对于 miR-9-5p NC组，HIC1 mRNA明显下调(P=0.045 2)。miR-9-5p inhibitor组相对于miR-9-5p inhibitor NC组，HIC1 mRNA明显上调(P=0.002 1)(见图6A)。蛋白质印迹试验结果显示 (见图6B、C)，上调与下调miR-9-5p的表达，HIC1蛋白表达相应地下调(P=0.004 2)与上调(P=0.034 3)。RT-PCR的mRNA表达和蛋白质表达表明miR-9-5p与HIC1的表达呈负相关。

图5 miR-9-5p inhibitor下调提高对多柔比星的敏感性

通过查询信息学数据库PicTar、TargetScan和miRBase，发现miR-9-5p与HIC1 mRNA的序列对应关系(见图7A)。构建双荧光素酶报告基因质粒，即将HIC1 3′UTR野生型序列 (WT HIC1)构建在pmirGLO双荧光素酶miRNA靶基因表达载体上。当加入miR-9-5p模拟物后，荧光素酶表达量下调，表明miR-9-5p直接靶向HIC1 mRNA的3′UTR(P＜0.000 1)(见图 7B)。

六、抑制HIC1表达对miR-9-5p inhibitor稳定表达细胞株的影响

转染siRNA HIC1组相对于siRNA NC组，HIC1 mRNA明显下调(P=0.001 7)，HIC1蛋白也明显下调(P=0.004 6)(见图8)。

与siRNANC组相比，siRNA HIC1组加入多柔比星浓度为 0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L 的细胞活力显著升高(P 值分别为 0.047 1、0.000 2、0.019 4、0.000 6)(见图9A)。与siRNA NC组相比，siRNA HIC1组凋亡细胞数明显减少(P=0.024 0)(见图9B、C)。以上结果表明，抑制HIC1的表达可逆转miR-9-5p下调的作用。

图6 HIC1的相对表达

图7 miR-9-5p与HIC1的关系

图8 转染siRNA后HIC1的表达

讨 论

多柔比星作为乳腺癌的常用化疗药物，可直接作用于DNA，插入DNA的双螺旋链，使DNA作为核酸合成模板的功能受损，抑制DNA和RNA的合成；还产生自由基，诱导DNA和细胞膜的损伤[7]。三阴性乳腺癌是一种特殊类型的乳腺癌，缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2。该疾病占乳腺癌的10%～20%，由于其异质性、缺乏特定的治疗靶点和易发生化疗耐药性，在乳腺癌中预后最差[8]。因此，研究三阴性乳腺癌细胞对化疗药多柔比星发生耐药的机制，寻找提高三阴性乳腺癌对多柔比星敏感性的方法十分重要。

图9 siRNA HIC1组与siRNA NC组对比

miRNA是一类进化上保守的小分子非编码RNA，长度19～23 bp[9]。成熟miRNA通过与靶基因信使 RNA(messenger RNA，mRNA)的 3′非翻译区(untranslated region，UTR)结合诱导其降解、翻译抑制或从翻译机制中截留靶向mRNA来调控基因的表达[10]。越来越多的研究表明，特定的miRNA可能作为肿瘤预测标志物和潜在治疗靶点，具有极大的临床应用价值[11]。

miRNA通过靶向目的基因的mRNA从而抑制其表达。每个miRNA可调节数百个不同mRNA的表达，同时每个mRNA物种可被多个miRNA靶向。因此，miRNA的调控系统非常复杂且动态，其调控使细胞精确表达基因[12]。miRNA不仅参与心血管疾病、神经退行性疾病、代谢疾病中，还在癌症的发生、发展中起不可忽视的作用[13]。研究表明，miR-9-5p 参与多种肿瘤的血管生成[14]、转移[15]、复发[16]并抑制肿瘤的凋亡[17]。在宫颈癌中，miR-9-5p通过靶向FOXO3抑制细胞凋亡[18]。在膀胱癌中，miR-9-5p通过抑制LASS2，提高细胞对化疗药顺铂的耐药性[19]。在小细胞肺癌中，对化疗药依托泊苷的敏感性提高与miR-9-5p的低表达相关[20]。在乳腺癌中，miR-9-5p表达升高可促进细胞增殖和抑制凋亡[21]。本研究首先比较人乳腺癌细胞系MDA-MB-231与人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中miR-9-5p的基础表达，发现MDA-MB-231细胞miR-9-5p的表达明显上调。然后通过慢病毒介导miR-9-5p转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231。结果发现在相同浓度多柔比星的作用下，上调miR-9-5p可提高细胞活性、抑制凋亡，而下调miR-9-5p可降低细胞活性，促进凋亡。该结果表明miR-9-5p可降低乳腺癌细胞MDA-MB-231对于多柔比星的敏感性。

HIC1是重要的抑癌基因，位于染色体17p13.3，并编码与早幼粒白血病锌指蛋白(promyelocytic leukemia zinc-finger，PLZF)家族密切相关的BTB/POZ(broad complex,tramtrack,and bricà brac/poxviruses and zinc-finger)域锌指转录抑制因子，其启动子在乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌等肿瘤中高度甲基化[22]。

HIC1编码一种转录抑制因子，其表达的下调在多种肿瘤中均预示着病程进展和不良预后[23]。Li等[24]证明，HIC1的下调可促进食管鳞状细胞癌上皮间质转化和其恶性病程。Zhou等[25]证明，HIC1可通过YAP信号通路抑制膀胱癌的增殖、迁移和侵袭。Feng等[6]证明，HIC1可通过抑制IL-6/STAT3信号通路提高乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性。笔者通过生物信息学分析预测，miR-9-5p可靶向HIC1的3′UTR，且通过RT-PCR、蛋白质印迹试验和双荧光素酶报告基因分析，确认HIC1是miR-9-5p的靶基因。前文已证明，miR-9-5p可降低乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性。为探究miR-9-5p的这种作用是否通过下调HIC1，笔者使用siRNA沉默HIC1的实验。选择miR-9-5p inhibitor稳定表达细胞株，转染HIC1 siRNA将升高的HIC1抑制进行后续研究。结果发现，抑制HIC1逆转miR-9-5p下调作用，提高细胞活力、抑制凋亡。该结果表明，miR-9-5p降低癌细胞对于多柔比星的敏感性是通过下调HIC1的表达而进行。

综上所述，本研究证明细胞中miR-9-5p可通过下调HIC1的表达，降低三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231对化疗药多柔比星的敏感性，且首次证明HIC1为miR-9-5p的靶基因。因此，本研究结果有助于解释乳腺癌细胞对多柔比星敏感性降低的机制，为研究新型辅助化疗药物以及为肿瘤细胞的靶向治疗提供参考。然而，不同的乳腺癌细胞可能存在差异。本研究仅采用MDA-MB-231乳腺癌细胞为研究对象，尚未在其他乳腺癌细胞和临床标本中进行验证，有待后续实验进一步探索。