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胰高血糖素样肽1通过类血管生成因子4调节糖尿病db小鼠棕色脂肪活性的机制

2020-06-24罗小敏冯英梅

首都医科大学学报 2020年2期
关键词:三酰脂肪组织甘油

颜 岑 罗小敏 冯英梅

(首都医科大学附属北京潞河医院中心实验室,北京 101149)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一组以慢性血糖升高,伴有代谢紊乱的临床代谢症候群,白色脂肪堆积形成的肥胖现已成为T2DM的主要危险因素。相反地,棕色脂肪能够摄取葡萄糖和三酰甘油将其转化成能量,从而维持血糖血脂的稳态,在T2DM中具有重要作用[1]。然而,在T2DM患者和肥胖的糖尿病db/db小鼠体内,棕色脂肪(brown adipose tissue,BAT)功能下降[2]。研究[3]显示,降糖药胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)由小肠内分泌细胞-L细胞分泌入血,它通过脑室胰高血糖素样肽1受体(glucagon-like peptide 1 receptor,GLP-1r)刺激交感神经,释放去甲肾上腺素,增加 BAT活性。

游离脂肪酸为棕色脂肪细胞活化提供能量来源,它是由三酰甘油分解而成,而类血管生成因子4(angiopoietin-like protein 4,ANGPTL4)通过调控脂蛋白酯酶,对三酰甘油分解成游离脂肪酸起到重要作用。ANGPTL4属于类血管紧张素家族,它在脂肪、肝脏组织表达,释放入血[4]。研究[5]显示,在T2DM患者外周血中ANGPTL4升高。那么ANGPTL4是否、如何参与小鼠棕色脂肪活性的调节,这个并不清楚。本课题通过db/db小鼠给予GLP-1类似物Exendin-4(Ex-4)促进BAT活性的模型和ANGPTL4缺失小鼠模型,探讨ANGPTL4调控BAT功能的机制。

1 材料与方法

1.1 动物实验

本研究采用雄性8周龄糖尿病模型db/db雄性小鼠和8周龄ANGPTL4-/-雄性小鼠,本研究所用的敲除小鼠都是以C57BL/6小鼠为背景进行基因敲除的。将db/db小鼠分为两组,以皮下植入渗透微泵的方式分别给予0.9%(质量分数)氯化钠注射液或GLP-1类似物Ex-4(20 nmol·kg-1·d-1)(美国Abcam公司),干预6周。取材前空腹过夜,取空腹血、肝脏和脂肪组织保存。整个动物实验得到首都医科大学附属北京潞河医院伦理委员会的批准。

1.2 葡萄糖耐量实验

小鼠禁食过夜,腹腔注射10%(质量分数)葡萄糖溶液(10 μL/g),检测时间点为0、15、30、60、90、120 min的血糖值。

1.3 外周血、肝脏和BAT总胆固醇、三酰甘油定量

剪取适量db/db小鼠的肝脏和棕色脂肪组织称质量后加入到组织细胞裂解液(中国普利莱公司)中,经匀浆和离心提取蛋白,BCA(美国Bio-Rad公司)试剂盒进行蛋白定量。取等量肝脏、BAT蛋白、血浆,用总胆固醇和总三酰甘油检测试剂盒(中国中生北控公司)进行检测。

1.4 快速蛋白液相色谱(fast protein liquid chromatography,FPLC)

取db/db小鼠的空腹血浆,采用FPLC分离脂蛋白[6]。

1.5 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

取空腹血以1∶2稀释,采用ELISA试剂盒,根据试剂盒说明书检测ANGPTL4。

1.6 正电子发射计算机断层显像(pet-CT)

采用正电子发射计算机断层显像(pet-CT)检测BAT活性(首都医科大学中心平台)。将处理好的小鼠,检测前1 d空腹过夜,尾静脉注射18F-FDG,采用异氟烷吸入式麻醉后,将小鼠固定在扫描床上,先进行CT扫描,再用三维采集方式采集发射数据,进行PET图像重建和图像融合处理。依据计算机生成的pet-CT融合图像,对棕色脂肪组织的平均标准摄取值(standerdized uptake value,SUV)进行定量分析。

1.7 总RNA提取和实时荧光定量PCR

为了检测BAT标志物的表达情况,采用Trizol(美国Invitrogen公司)法提取了小鼠BAT组织的总RNA,将其反转录为cDNA,反转录体系为20 μL,反应条件为42 ℃ 60 min,70 ℃ 15 min,使用β-actin作为内参,在 Light Cycler 96仪器(美国Roche公司)上检测RNA 的表达情况,并进行统计分析。所需引物序列如下:UCP-1:正向引物5′-CTGCCAGGACAGTACCCAAG-3′,反向引物5′-TCAGCT GTTCAAAGCACACAAA-3′,PGC-1α:正向引物5′-TGTGTGCTGTGTGTCAGAGT-3′,反向引物5′-TGGTCGCTACACCACTTCAA-3′。

1.8 Western blotting法检测

剪取脂肪组织加入到适量组织细胞裂解液中[含1%(质量分数)蛋白酶抑制剂],匀浆后离心取上清,用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度,用10%(质量分数)的SDS凝胶分离等量蛋白,再转印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,用5%(质量分数)脱脂奶粉封闭1 h,孵育一抗4 ℃过夜,洗膜后再室温孵育二抗1 h,再次洗膜,最后用凝胶成像系统曝光(美国自然基因科技有限公司,Flour Chem),Image J软件分析结果。其中一抗UCP-1(美国CST公司)、PGC1-α(美国CST公司)、Oxphos(美国Abcam公司)、ANGPTL4(美国CST公司)、β-actin(美国CST公司)的浓度是1∶1 000。

1.9 转录组测序RNA序列

取同龄野生、ANGPTL4 -/-小鼠同侧BAT,Trizol法提取总RNA,取等量RNA(1 μg)建立 cDNA库,进行RNA测序。采用参考文献[7]方法,以伪发现率(false discovery rate,FDR)≤0.05为起点,筛选出户差异表达基因再进行富集分析(R package edgeR)。

1.10 统计学方法

采用 GraphPad Prism统计软件进行统计分析,数据用均数±标准误(mean±SE)表示,组间比较采用Student’sttest。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GLP-1类似物Ex-4对糖尿病db/db小鼠血糖血脂的作用

将8周龄的db/db小鼠皮下埋泵给药Ex-4或者0.9%(质量分数)氯化钠注射液,6周后,葡萄糖耐量实验显示,与埋泵0.9%(质量分数)氯化钠注射液组相比,埋泵Ex-4组的小鼠血糖浓度在0、15、30、60、90、120 min 这6个时间点均降低,差异有统计学意义(图1A)(P<0.05)。以FPLC分离空腹血脂蛋白,发现Ex-4降低了极低密度脂蛋白的三酰甘油,但对脂蛋白的胆固醇没有影响(图1B、C)。Ex-4组与0.9%(质量分数)氯化钠注射液组比较,三酰甘油显著降低[(1.36±0.21) mmol/Lvs(0.82±0.10) mmol/L,P=0.028)],而胆固醇差异无统计学意义[(4.68±0.52) mmol/Lvs(3.58±0.37) mmol/L,P=0.110, 图1D]。

图1 GLP-1类似物Ex-4对糖尿病db/db小鼠血糖血脂的作用

将等量的肝脏和BAT进行三酰甘油和胆固醇定量,Ex-4处理降低了BAT三酰甘油的浓度[(10.45±2.64) mmol/μgvs(4.86±1.15) mmol/μg,P=0.044],但肝脏三酰甘油浓度没有变化[(1.68±0.12) mmol/μg 蛋白vs(1.50±0.17) mmol/μg,P=0.600](图1E),此外,与0.9%(质量分数)氯化钠注射液组比较,Ex-4组肝脏和BAT的胆固醇浓度没有显著改变[肝脏:(2.31±0.12) mmol/μgvs(2.14±0.23) mmol/μg,P=0.620;BAT:(2.94±0.58) mmol/μgvs(3.45±0.49) mmol/μg,P=0.610]。

2.2 db/db小鼠的棕色脂肪活性

将Ex-4、0.9%(质量分数)氯化钠注射液处理的db/db小鼠进行pet-CT分析BAT活性。与对照组相比,Ex-4处理有增加BAT活性的趋势(2.23±0.10)% ID/gvs(2.50±0.09)% ID/g,P=0.056)(图2A、B)。Western blotting法验证了pet-CT的结果,Ex-4组BAT的UCP-1的表达是0.9%(质量分数)氯化钠注射液组的1.5倍(P=0.041)(图2C)。Ex-4组BAT的Oxphos组分ATP5A、MTCO1、SDHB的表达分别是0.9%(质量分数)氯化钠注射液组的2.1倍(P=0.032),1.8倍(P=0.350),和2.3倍(P=0.090)(图2E、F)。

图2 Ex-4对db/db小鼠的棕色脂肪活性作用

2.3 棕色脂肪组织中ANGPTL4表达

检测了db小鼠外周血和BAT中ANGPTL4的表达。与0.9%(质量分数)氯化钠注射液组比较,Ex-4组ANGPTL4在外周血中浓度没有变化[(7.61±0.97) ng/mLvs(7.57±1.05) ng/mL,P=0.980](图3A),但在BAT中表达增加了1.66倍(ANGPTL4/β-actin:0.89±0.12vs1.47±0.13,P=0.005)(图3B、C)。

图3 Ex-4对棕色脂肪组织中ANGPTL4作用

2.4 ANGPTL4-/-小鼠棕色脂肪活性

与野生对照组比较,ANGPTL4-/-小鼠表现为外周血低胆固醇和低三酰甘油[总胆固醇:(2.29±0.15) mmol/Lvs(1.42±0.14) mmol/L,P=0.001;总三酰甘油:(0.73±0.16) mmol/Lvs(0.33±0.03) mmol/L,P=0.015](图4A)。ANGPTL4-/-小鼠空腹血糖和糖耐量与野生小鼠相似(图4B)。当从BAT提取RNA,qPCR检测结果发现ANGPTL4-/-小鼠UCP-1的表达浓度明显低于正常野生组(图4C)。与之相应,与野生对照小鼠相比,ANGPTL4-/-小鼠BAT中ATP5A、MTCO1、SDHB和UCP-1的蛋白表达浓度分别降低了66%、57%、47%、53%(P<0.01)(图4D、 E)。

图4 ANGPTL4缺失棕色脂肪活性

2.5 ANGPTL4调节BAT活性分析

将野生、ANGPTL4-/-小鼠BAT进行RNA序列分析。与野生BAT相比,ANGPTL4-/-小鼠BAT有267个基因增加1.5倍及以上,有220个基因降低了1.5倍及以上(图5A、 B)。富集分析结果显示差异基因表达的前20个通路中,凋亡通路位居前5位,与野生小鼠相比,ANGPTL4-/-小鼠BAT细胞凋亡可能增加(图5C)。

图5 ANGPTL4调节BAT活性的机制

3 讨论

迄今为止,众多研究发现棕色脂肪细胞对能量稳态的调控作用。其机制是,棕色脂肪细胞含有大量的脂滴和线粒体,通过线粒体UCP-1将大量质子势能转化成能量;相反,白色脂肪细胞里线粒体数量很少,它是储存能量的脂肪[8]。BAT位于肩胛骨区、颈部锁骨上区、脊柱两侧,周围富含毛细血管,细胞表面遍布交感神经纤维,而交感神经系统释放的去甲肾上腺素正是活化BAT的经典激活剂。随着年龄的增长,BAT活性下降[9]。如何增加BAT活性,进而控制糖尿病代谢紊乱,正是目前研究热点之一。

GLP-1类似物,即GLP-1受体激动剂,空腹下GLP-1分泌浓度很低,随着进食,K细胞迅速分泌大量的GLP-1,它通过胰岛β细胞表达GLP-1r,促进胰岛素释放[10];抑制胰岛α细胞释放胰高血糖素[11];它通过门静脉的葡萄糖感受器上的GLP-1r,启动迷走神经反射回路,将信号传导到下丘脑,调控进食和延迟胃排空[12]。研究[10]显示,给野生小鼠脑室注射GLP-1类似物Ex-4,可以刺激胰岛素释放,而对GLP-1r-/-小鼠没有刺激作用,这提示在脑室中有GLP-1r的表达。因为空腹下GLP-1浓度很低,并不刺激胰岛素释放,这一优点大大降低了糖尿病患者治疗时出现低血糖的概率。此外,GLP-1能有效降低血糖、减重,对心肌细胞[13-14]、血管内皮细胞[13,15]、肾脏[16]等具有保护作用,还降低高脂饮食下VLDL生成,对脂肪肝有抑制作用[17-18]。总之,GLP-1具有调控血脂代谢,对胰岛、心脏、肾脏等器官具有保护作用。

GLP-1对脂肪组织具有重要调控作用:GLP-1受体在脑室和脂肪组织表达[3,19],在白色脂肪方面,GLP-1促进葡萄糖的摄取和脂肪分解[16],给高脂小鼠注射GLP-1,可以增加白色脂肪UCP-1的表达,提示GLP-1增加米色脂肪活性[20];在棕色脂肪方面,GLP-1促进BAT的产热:给野生和GLP-1r-/-小鼠喂饲高脂饮食,室温下能量消耗相似,但低温下GLP-1r-/-小鼠产能明显下降,提示GLP-1r-/-小鼠BAT功能下降[19]。目前研究[21-22]报道的GLP-1调节BAT的机制是:GLP-1通过脑室GLP-1r刺激交感神经,释放去甲肾上腺素,增加BAT活性。

糖尿病合并非乙醇性脂肪肝患者高达糖尿病患者群体的70%~75%[23]。对NASH患者研究[24]发现,GLP-1可降低脂肪合成,以及脂肪分解成游离脂肪酸,改善了肝脏对胰岛素的敏感性。在本研究中,GLP-1受体激动剂Ex-4降低了糖尿病db/db小鼠外周血和BAT中三酰甘油浓度,但不影响肝脏三酰甘油浓度。因此,GLP-1受体激动剂对血脂和组织器官内胆固醇和三酰甘油的代谢作用,有待进一步研究。

三酰甘油为棕色脂肪细胞提供能量来源,而ANGPTL4对三酰甘油代谢具有重要调控作用。ANGPTL4属于类血管生成家族成员,它从多种细胞分泌。当ANGPTL4分泌入血后,它被分解为N-末端片段(含有抑制脂蛋白酯酶活性区,可形成低聚物)和C-末端片段(含有纤维蛋白原样结构,保持单聚体状态)[25-26]。ANGPTL4的表达受胰岛素调节:在正常人做葡萄糖钳夹测试表明,胰岛素降低脂肪组织ANGPTL4的表达和外周血的ANGPTL4浓度[27];当外周血中游离脂肪酸的增加,可以增加过氧化物酶体增生物激活受体γ的活性,促进其靶基因ANGPTL4的表达[28];炎性反应刺激巨噬细胞分泌ANGPTL4[5]。本研究结果提示ANGPTL4参与调控BAT活性,扩展了对该蛋白生理病理功能的认识。

综上所述,本研究结果显示GLP-1促进棕色脂肪活性伴有ANGPTL4表达浓度的升高,ANGPTL4的缺失降低了棕色脂肪活性和功能,可能成为棕色脂肪活性调控的治疗靶点,在ANGPTL4缺失小鼠中,Ex-4是否还能促进BAT活性尚不明确,还有待进一步的研究。

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