不同固定剂对鼻息肉上皮细胞免疫荧光染色的影响

李 颖 矫 健 张 罗*

(1. 首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科，北京 100730; 2. 北京市耳鼻咽喉科研究所 耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室(首都医科大学)，鼻病研究北京市重点实验室，北京 100005)

鼻息肉是多种致病因素作用下鼻黏膜的慢性持续性炎性反应。近年来，对其发病机制的研究不断深入。体外培养细胞免疫荧光染色作为基本技术手段普遍应用于研究中，对于不同的标记蛋白，固定剂的选择对染色结果起着至关重要的作用。为探讨不同固定剂对不同标记蛋白免疫荧光染色结果的影响，笔者选择了3种细胞染色中常用的固定剂及4种研究中用到的不同结合部位的标记蛋白，应用于此研究中。为在鼻息肉发病机制的研究中，细胞免疫荧光染色最佳固定剂的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织细胞培养

无菌条件下取鼻息肉组织, 浸泡于含有双抗的0.9%(质量分数)氯化钠注射液中, 浸泡并冲洗3 遍,置于0.1%(质量分数)蛋白酶(美国Sigma公司)中，4 ℃过夜后5%(体积分数) FBS终止消化，离心收集上皮细胞，以2.5×105/mL密度接种于四孔培养板中盖玻片上，加入培养液，37 ℃ 5%(体积分数)CO2培养箱中培养，每2～3 d换液1次。第七天终止培养。

1.1.2 主要试剂及仪器

兔多克隆抗紧密连接蛋白(zonular occludens-1，ZO-1)抗体购自美国Invitrogen公司；鼠单克隆抗β-微管蛋白(tubulin)抗体购自美国Sigma公司；兔多克隆抗跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)抗体, 兔多克隆抗组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylases1,HDAC1)抗体购自美国Abcam公司； 罗丹明标记羊抗鼠IgG，罗丹明标记羊抗兔 IgG购自美国Merck公司；含DAPI荧光封片剂购自美国abcam公司等。IX81激光共聚焦显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 实验方法

将培养好的细胞分为1、2、3、4四组，每组为6个细胞爬片，弃掉培养液，用PBS洗一遍，每组分别用4%(质量分数)多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)、等体积甲醇丙酮及甲醇3种固定剂固定(每种固定剂固定两张细胞爬片)，室温固定10 min，分别用PBS洗3遍，1%(体积分数)Triton X-100透膜10 min，PBS洗3遍，封闭用山羊血清封闭非特异性染色20 min，第1组滴加一抗ZO-1 1∶100、第2组滴加一抗β-tubulin 1∶500、 第3组滴加一抗TMEM16A 1∶100、 第4组滴加一抗HDAC1 1∶100，4 ℃孵育过夜，PBS洗3遍，分别滴加罗丹明标记羊抗鼠IgG 1∶100，或罗丹明标记羊抗兔IgG 1∶100相应荧光二抗，室温避光孵育1.5 h，PBS洗3遍，含DAPI封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察、照相。

1.3 实验结果判定方法

同一标记蛋白在扫描参数相同的情况下，将图像调至相对最清晰时进行40倍扫描获取图像。结合图像的荧光强度及抗体结合的特异程度，对结果进行判定。

2 结果

2.1 第1组(ZO-1组)染色结果

4%(质量分数)PFA固定的细胞ZO-1在细胞密集区的细胞紧密连接处呈阳性表达，但染色不清晰，且有细胞质非特异性背景染色。等体积甲醇丙酮混合液和甲醇固定的细胞ZO-1细胞密集区细胞紧密连接处呈阳性表达，且染色清晰，几乎无细胞质非特异性背景染色(图1)。

图1 免疫荧光染色3种不同固定剂固定的ZO-1染色结果

2.2 第2组(β-tubulin组)染色结果

4%(质量分数)PFA、等体积甲醇丙酮混合液及甲醇固定的细胞β-tubulin骨架蛋白染色均层次清晰，微丝结构完整，立体感较强，无非特异性背景染色，尤以甲醇固定的结果更为突出(图2)。

2.3 第3组(TMEM16A组)染色结果

4%(质量分数)PFA固定的细胞TMEM16A几乎无特异性染色。等体积甲醇丙酮混合液及甲醇固定的细胞细胞膜及细胞质蛋白阳性表达清晰明显，背景清晰(图3)。

2.4 第4组(HDAC1组)染色结果

4%(质量分数)PFA、等体积甲醇丙酮混合液及甲醇固定的细胞HDAC1细胞核阳性均染色较强，核质清晰，无非特异性背景染色(图4)。

图2 免疫荧光染色3种不同固定剂固定的β-tubulin染色结果

图3 免疫荧光染色3种不同固定剂固定的TMEM16A染色结果

图4 免疫荧光染色3种不同固定剂固定的HDAC1染色结果

3 讨论

免疫荧光染色中固定的目的是迅速终止酶的活性，避免组织细胞结构的解体，将抗原稳定固定在原位，并保持其抗原性。良好的固定剂应能保持细胞及亚细胞结构的真实性，并使抗体大分子进入细胞内与抗原结合[1]。一般生物学实验室常用的固定剂分为两大类：有机溶剂和交联剂[2]。有机溶剂如丙酮及醇类等，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。交联剂如PFA，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其优点是组织穿透性强，收缩性小[3]。在日常免疫荧光染色实验中笔者发现，不同的固定剂对实验结果起着至关重要的作用，有时还会产生不同的结果。为验证固定剂对免疫荧光染色结果的影响和为今后的实验提供实验基础，选用了细胞染色中较常用的4%(质量分数)PFA、等体积甲醇丙酮混合液及甲醇3种固定剂，应用于本研究中。为了保证实验结果的可比性，笔者经反复实验，将4种标记蛋白的实验条件进行优化，确定出除固定剂外的最佳实验条件，用优化后的实验条件对固定后的细胞进行染色，观察3种固定剂对不同标记蛋白的固定效果。

微管蛋白属细胞骨架蛋白，是细胞骨架纤维中最粗的一种,分为3大类α-tubulin、β-tubulin 和γ-tubulin[4]。其中β-tubulin常被用于免疫染色观察细胞的微管结构[5]。微管不仅与细胞形态密切相关, 而且参与细胞的运动、物质转运、信息传递以及细胞分裂、分化、基因表达等多种功能。因此β-tubulin 正常排列的破坏及表达异常与纤毛的功能异常、细胞损伤等密切相关。有机溶剂固定剂在去除脂质使细胞脱水的同时，使蛋白质瞬间沉淀在细胞骨架上。作为一种胞外的细胞骨架蛋白，3种固定剂均取得较好的固定效果，尤其是甲醇固定的β-tubulin染色极其清晰。

上皮的屏障功能依赖于上皮细胞的完整性和细胞间相连接的连接复合体，其中起决定性作用的是紧密连接[6]。紧密连接的屏障功能受不同外源性刺激的动态调节，与人类健康和对疾病的易感性密切相关[7]。紧密连接功能失调、细胞间通透性增高，炎性反应介质进入，激发黏膜免疫系统，导致炎性反应和组织损伤。紧密连接位于细胞与细胞之间连接的最顶端，由紧密连接相关蛋白组成。ZO-1是最具特征的胞质紧密连接蛋白[8]。4%(质量分数)PFA作为一种能较好保护抗原结构的固定剂，广泛应用于细胞免疫组织化学染色中，但由于它的作用温和可能会损失某些细胞成分的抗原性。虽然笔者在实验中增加了打孔透膜步骤，但ZO-1的染色结果还是不够理想。而等体积甲醇丙酮混合液及甲醇的固定效果都很好，紧密连接染色清晰锐利。

TMEM16A属于具有多次跨膜结构的蛋白质家族——TMEM16 家族。2008年，3个独立的研究小组分别从不同角度验证钙激活氯离子通道 (calcium-activated chloridechannels，CaCCs)的1个分子身份为TMEM16A[9]。众所周知， CaCCs 最重要的功能之一是在上皮细胞中为氯离子的分泌提供路径。在许多上皮组织中，都观察到TMEM16A的高表达，包括呼吸道上皮[10]、唾液腺[11]、胰腺导管细胞[12]和肠道上皮细胞[13]。因而，对于TMEM16A在上皮细胞液体分泌过程中作用的研究十分重要。TMEM16A表达于胞膜和胞质中，除4%(质量分数)PFA固定细胞未见阳性表达外，其余两种固定剂固定的细胞均见较好的胞膜及胞质阳性表达。

HDAC1是哺乳动物的第一个组蛋白去乙酰化酶，在组蛋白乙酰化水平的调控过程中发挥重要作用[14]。HDAC1蛋白由482个氨基酸组成,相对分子质量为55 000, HDAC1蛋白能够降低组蛋白的乙酰化水平, 促使染色体形成一个超螺旋结构, 抑制机体内正常基因的表达, 促进肿瘤的生长, 主要存在于细胞核内, 能够调控细胞的生长[15]。近年来也应用于鼻息肉的研究中。作为一种胞核蛋白，3种固定剂均取得了较好的固定效果。

综上所述，等体积甲醇丙酮混合液及甲醇在骨架蛋白、细胞连接蛋白、细胞膜和细胞质蛋白、胞核蛋白的染色中均取得较好的固定效果，4%(质量分数)PFA对细胞连接蛋白和胞浆蛋白的固定效果不理想。一般来说，有机溶剂固定剂用于细胞骨架成分的固定，交联剂固定剂用于膜相关成分的固定。但这并不是绝对的，本结果就与之不完全相同。因为不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大[3]。而且每一种固定剂都有它的长处和短处，没有一种固定剂适用于所有标记蛋白，必要时，可作多种固定剂对比，从而选出理想的固定方法。根据笔者的经验，在细胞免疫荧光染色中要结合所要检测抗原的结构特点和不同固定剂的特性，来对固定剂进行选择。其次，抗体生产厂家的选择、打孔步骤的添加、细胞的培养状态等等均对实验结果有着至关重要的影响。本实验仅对鼻息肉发病机制研究中用到的几种标记蛋白的固定剂选择进行了探究，以期为此项研究的细胞免疫荧光染色实验提供参考依据，奠定实验基础。