IL-23在慢性鼻窦炎中的表达和作用

王 敏 李 颖 王向东 张 罗

(首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科 北京市耳鼻咽喉科研究所 耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室 鼻病研究北京市重点实验室，北京 100005)

慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis，CRS)按照是否合并鼻息肉(nasal polyps，NP)分为慢性鼻窦炎不合并鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)和慢性鼻窦炎合并鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)。CRSsNP主要是以Th1反应为主，在欧洲CRSwNP主要以Th2反应为主，在亚洲除了Th2反应，Th17反应也是主要参与通路之一[1-3]。

白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23)属于IL-12家族成员，为异二聚体，包括IL-23特异性的p19亚单位和与IL-12共享的p40亚单位。IL-23受体相应的也为异二聚体，由IL-12Rβ1和IL-23R两个亚单位组成。IL-23R主要表达在T细胞、自然杀伤T细胞(natural killer T cell，NKT)、单核细胞和树突细胞。IL-23在Th17细胞的分化中具有重要作用，但是IL-23并不能促使初始T细胞(naive T cell)体外向Th17细胞分化，因为naive T cell表面无IL-23R表达。Naive T cell首先在转化生长因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)、IL-6和IL-21的作用下形成承诺性Th17细胞，这种细胞表面有IL-23R的表达，随后在IL-23的作用下分化成Th17细胞[4]。IL-23-Th17通路参与了多种疾病的发生，例如牛皮癣[5]、 关节炎[6]、炎性肠病[7]等。有研究[8]证实IL-23在CRSwNP表达增高，但其在NP中的作用机制尚不清楚。本研究主要探讨了IL-23因子在CRSsNP和CRSwNP中的表达及与Th17反应的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

募集15例受试者(正常对照组)，14例CRSsNP患者(CRSsNP组)和37例CRSwNP患者(CRSwNP组)，取因解剖变异而进行鼻中隔成形术的正常对照组受试者的下鼻甲，CRSsNP组患者的筛窦黏膜和CRSwNP组患者的NP组织。依据临床检查、鼻内镜和CT检查结果确诊CRSsNP和CRSwNP 病例[9]。本研究与前期研究的研究对象相同，研究对象的临床特征详见前期研究[10]。

1.2 组织匀浆的制备

组织匀浆的制备参考前期研究[10]。简单处理过程为冻存的组织称质量，自动匀浆机匀浆2 min，用含有1%(质量分数)蛋白酶抑制剂的0.9%(质量分数)氯化钠注射液溶解，然后离心收集上清，-70 ℃保存，用于细胞因子IL-23、IL-17 和髓过氧化物酶(myelo-peroxidase, MPO)的检测。

1.3 NP组织单个细胞悬液的制备和体外刺激

NP组织单个细胞悬液采用酶消化法制备，参考前期研究[11]。简单的处理过程为将新鲜的NP组织用剪刀剪成小块，然后移入Gentle MACs 管(Miltenyi Biotec公司, 德国)中，在Gentle MACs 仪器(Miltenyi Biotec公司，德国)上绞碎，离心收集绞碎的组织用2 mg/mL 胶原酶(Gibco Life Technologies公司, 英国)和0.04 mg/mL DNAse1(Roche Diagnostics公司, 德国)，37 ℃消化45 min，然后在Gentle MACs仪器上再次绞碎，离心收集细胞，70 μm 细胞筛(BD Falcon公司, 美国)过滤，裂解红细胞后收集细胞。

将上述NP组织单个细胞用100 ng/mL的IL-23(R&D Systems公司，美国)刺激24 h，然后收集培养上清，后续检测IL-17、IL-1β、IL-8和粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)浓度。

1.4 细胞因子检测

采用Luminnex 法检测鼻黏膜组织IL-23、IL-17 和MPO浓度(Magnetic Luminex Performance Assay, R&D Systems; 美国)；NP组织单个细胞培养上清IL-17、IL-1β、IL-8和G-CSF浓度(Bio-Rad公司, 美国)。

1.5 外周血中性粒细胞分析

外周血中性粒细胞数目和百分比采用标准的全自动细胞计数仪进行分析。

1.6 组织中性粒细胞计数

将鼻黏膜组织石蜡包埋后进行苏木精-伊红染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)染色，然后随机选取10个高倍视野(400×)，计数中性粒细胞数目，表示为“平均中性粒细胞数目/高倍视野”。

1.7 统计学方法

结果用GraphPad Prism 5.0 软件包(Graphpad Software, San Diego, CA, 美国)分析。数据以M(P25,P75)表示。组间比较用Mann-WhitneyU-test，刺激前后比较用Wilcoxon signed rank test。相关分析采用Spearman法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-23在慢性鼻窦炎中的表达

与正常对照组相比，IL-23的浓度在CRSsNP组未见增高；CRSwNP组作为一个整体有增高趋势，但差异无统计学意义(图1A)。对照组15例中有0例IL-17阳性表达，14例CRSsNP组患者中只有4例IL-17阳性表达，而37例CRSwNP组患者中有23例IL-17阳性表达，因此，与正常对照组及CRSsNP组相比，CRSwNP组有明显的IL-17亚群的存在。将CRSwNP组按照IL-17蛋白能否检出进一步分为IL-17-CRSwNP和IL-17+CRSwNP两个亚组，可以看出IL-23在IL-17+CRSwNP组的表达显著高于IL-17-CRSwNP组及正常对照组(图1B)。

图1 IL-23在CRSsNP和CRSwNP(A)及IL-17-CRSwNP和IL-17+CRSwNP(B)患者鼻黏膜组织匀浆的浓度

2.2 IL-23与中性粒细胞相关指标的相关性

相关性分析显示鼻黏膜组织IL-23浓度与MPO浓度呈正相关，但是与组织中性粒细胞的数目无相关性；与外周血中性粒细胞数目呈负相关，详见表1。

表1 全部研究对象组织匀浆中IL-23浓度与中性粒细胞性指标的相关性

IL-23: interleukin-23;MPO: myelo-peroxidase.

2.3 IL-23细胞因子体外对NP组织中Th17因子生成的调节

IL-17、IL-1β、IL-8和G-CSF为Th17免疫通路的重要因子。IL-23体外刺激NP组织单个细胞悬液能够显著上调IL-17和IL-1β的生成，但对IL-8和G-CSF的表达没有影响(图2)。

3 讨论

以往研究[8]报道,NP组织IL-23阳性细胞数、IL-23蛋白水平和IL-23p19mRNA水平显著高于正常鼻黏膜组织[8]。与此结果相似，笔者发现CRSwNP患者的NP组织IL-23蛋白水平有增高趋势，但差异无统计学意义。尽管欧洲的CRSwNP患者主要以Th2反应为主，但是亚洲CRSwNP患者同时还存在Th17反应[1]。因此，按照NP组织IL-17能否检出，笔者将CRSwNP患者进一步分为IL-17阳性和阴性两个亚组，发现IL-17阳性CRSwNP组鼻黏膜组织IL-23蛋白水平显著高于正常对照组和IL-17阴性CRSwNP组，提示IL-23可能参与了CRSwNP中的Th17反应。

图2 IL-23刺激对NP组织单个细胞中Th17相关因子生成的调节

尽管以往研究[5-7]报道，IL-23-Th17通路参与了多种疾病的发生，但是CRSwNP中IL-23与Th17反应的关系尚未见报道，因此本研究对此做了进一步的探讨。由于NP组织单个细胞悬液能够更好地模拟体内NP的环境，本研究选择此体系观察了IL-23体外刺激对NP组织Th17反应的影响。IL-17是Th17通路的主要效应因子，可以诱导IL-8和G-CSF的生成，进而募集中性粒细胞的聚集和活化，而IL-1β主要参与Th17细胞的分化[12-14]。本研究显示，IL-23能够增强IL-17和IL-1β的生成，但是对IL-8和G-CSF的生成没有影响，支持IL-23对CRSwNP中的Th17反应有正向调节作用。但是尽管Th17细胞是IL-17因子的主要来源，活化的CD8+T细胞[15]、中性粒细胞[16]和嗜酸性粒细胞[17]也能够生成IL-17。NP组织单个细胞悬液虽然能够更好地模拟体内NP的环境，但是由于此体系是多种细胞的混合，无法确定IL-23诱导IL-17生成的具体细胞，需要后续用特定的细胞进一步研究。

研究者[18-19]通常认为Th17反应能够促进中性粒细胞炎性反应。而且，有研究[20]报道IL-23能够不依赖IL-17促进小鼠肠炎模型中中性粒细胞的募集。笔者观察了组织IL-23浓度与中性粒细胞的关系，结果显示，鼻黏膜组织IL-23浓度与MPO浓度呈正相关，但是与组织和外周血中性粒细胞的数目无相关性。而且，笔者的前期研究[11]结果显示，IL-17浓度也与MPO浓度呈正相关，但是与组织和外周血中性粒细胞的数目无相关性。与此一致，Choy等[21]在Th17亚型的哮喘中也未观察到外周和组织中中性粒细胞数目的增多，这些结果支持Th17炎性反应中中性粒细胞的活性可能比数目更重要。

总之，IL-23在CRSsNP和IL-17阴性CRSwNP的发生中可能没有发挥作用，但可能通过调节Th17通路参与了IL-17阳性CRSwNP的发生。