基于Oncomine数据库分析PD-L1基因在头颈部癌中的表达及预后*

朱娅，丁洁，王莉，王娟，汪洋

210011 南京，南京医科大学第二附属医院 肿瘤科

头颈部癌占所有恶性肿瘤的6%，所有癌症相关死亡中的2%[1]，全球发病率约为1/600 000[2]。据报道，吸烟与其发病有较高相关性，此外人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染，特别是HPV16,也是口咽部鳞癌的主要病因[3]。尽管手术、放化疗和靶向治疗已联合用于这类患者，但近50%的患者最终死于原发疾病。近年来，免疫检查点抑制剂成为了新的有效治疗手段，在许多恶性肿瘤中取得了进展。免疫检查点抑制剂能够激活免疫系统，引导机体产生持续而有效的抗肿瘤免疫反应。头颈部鳞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)被认为是免疫缺陷肿瘤，它的发病与免疫逃逸机制有相关性。研究发现，HNSCC表面存在程序性死亡因子配体1(PD-L1/CD274)过度表达，特别在HPV(+)肿瘤中，由此引起PD-1/PD-L1通路上调，产生免疫抑制[4]。多项研究显示，PD-1/PD-L1靶向抑制剂在晚期及转移性头颈部癌中取得了有效的治疗效果[5-7]。

Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/resource/login.html)是癌基因芯片及整合数据平台，可用于查询及分析恶性肿瘤基因的相关信息。利用Oncomine数据库进行肿瘤及正常组织的差异基因分析，可寻找肿瘤标志物及治疗靶点，指导肿瘤预后及靶向治疗。本文从Oncomine数据库中提取头颈部癌PD-L1基因数据，比较了肿瘤组织及正常组织PD-L1的差异表达，并对亚组进行分析，同时结合高低表达的生存状态，研究PD-L1的表达与预后之间的相关性，进一步指导靶向药物的合理使用。

1 资料和方法

1.1 数据提取

从Oncomine数据库中提取头颈部癌的PD-L1表达的mRNA数据，设定搜索条件：1)Gene：PD-L1(CD274); 2) Analyze type: Head and Neck Cancer, CancervsNormal; 3) 分析参数为P-value<0.05，Fold change=1.5, Gene rank=top 10%; 4) 数据类型：mRNA。

1.2 统计学方法

头颈部癌肿瘤组织和正常组织PD-L1基因表达差异采取t检验。PD-L1表达量的高低与预后的关系采用Log-rank检验(生存分析)，检验参数P=0.05，所有检验均采用Graphpad Prism 8.0.2软件。

2 结 果

2.1 PD-L1在头颈部癌的表达结果

PD-L1基因癌组织/正常组织表达量分析共176项，癌组织中高表达的共4类肿瘤，分别为：结直肠癌、头颈部癌、肝癌及淋巴瘤。低表达的2类肿瘤，分别是食管癌和胰腺癌。在其余的14类肿瘤中均未有满足条件的结果。在头颈部癌中，满足癌组织高表达的研究共1项(1/6)，无满足要求的低表达研究；在离群值(Outlier)的13项研究中，共3项显示高表达，2项显示低表达(图1)。整合头颈部癌中PD-L1高表达的这6项研究(共10项分析)的结果显示，PD-L1基因在头颈部癌中的所有差异基因中排名第4 121位(P<0.05)，提示PD-L1在头颈部癌中较正常组织呈高表达，去除2个关于甲状腺癌的研究后，共包括242例样本的8项分析，结果显示PD-L1在其所有差异基因中排名为第4 374位(P<0.05)，提示在肿瘤组织中显著高表达(图2)。

图1 Oncomine数据库中PD-L1在多种肿瘤中的表达

Figure 1. PD-L1 Expression of Multiple Tumors in Oncomine Database

Red represents the number of high-expression studies of PD-L1 that meet the requirements. The darker the color, the higher the expression. Blue represents the number of studies with low expression of PD-L1. The darker the color, the lower the expression.

图2 PD-L1在头颈癌中的表达结果

Figure 2. PD-L1 Expression in Head and Neck Cancers

A.PD-L1 expression in 10 analyses of head and neck cancers; B. After removing 2 studies of thyroid cancer, PD-L1 expression in 8 analyses of head and neck cancer. The bars show the results of studies with high expression of PD-L1 (CD724). The darker the color, the higher the PD-L1 expression in the chip.

2.2 PD-L1在肿瘤组织与正常组织的表达差异

去除甲状腺癌的2项分析后，在剩余 8项头颈癌数据分析中，PD-L1表达的癌组织/正常组织差异(图3)。

图3 PD-L1在头颈部癌组织与正常组织的表达

Figure 3. PD-L1 Expression of Tumor Tissue and Normal Tissue in Head and Neck Cancer

A. Peng et al; B. Sengupta et al; C. Pyeon et al; D. Ye et al.

2.3 PD-L1表达与HPV状态的相关性

根据Oncomine数据库对于临床病理资料的分类结果，共83例样本提供了HPV状态。在HPV(+)的33例HNC患者中，PD-L1的平均表达量为0.38，在50例HPV(-)患者中，PD-L1的表达量为0.16，两者差异有统计学意义(P=0.018)(图4A)。

图4 PD-L1在不同分类肿瘤组织中的表达差异

Figure 4. PD-L1 Expression in Different Tumor Status

A.PD-L1 expression in different HPV status; B. PD-L1 expression in different M stages.

2.4 PD-L1表达与病理分级及肿瘤转移的相关性

在可获得肿瘤病理分化程度的53例标本中，其中Grade 1～2级患者32例，Grade 3～4级患者21例，PD-L1在Grade 1～2级患者中的平均表达表达量为0.37，在Grade 3～4级患者中的表达量为0.34，差异无统计学意义(P=0.836)。可获知转移情况的79例标本中，37例有远处转移，其PD-L1平均表达量为1.36， 42例无远处转移，PD-L1平均表达量为0.55，转移组的PD-L1表达显著高于非转移组，差异有统计学意义(P=0.004)(图4B)。

2.5 PD-L1表达与生存的相关性

为了研究PD-L1表达量与预后的相关性，从Oncomine数据库提取了80例标本，均可提供PD-L1基因表达数据、生存状态及生存时间相关信息，包括口腔、口咽、下咽及舌鳞状细胞癌4个癌种，男女比例为19∶1，中位年龄58.5岁，具体临床信息见表1。分析后绘制出生存曲线，选取mRNA表达量中位数作为界值，其中高表达及低表达均为40例，中位生存时间分别为80个月及54个月。经过log-rank检验后结果显示PD-L1表达与预后无显著相关性[PD-L1(+)/PD-L1(-)，HR:0.745，P=0.417]。我们再次用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn)验证HNSCC PD-L1mRNA表达与生存时间关系，发现PD-L1表达量与生存期仍然无显著相关性(图5)。

表1 80例头颈部鳞癌患者临床信息

Table 1. Clinical Information of the 80 Patients with Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

VariableOral cavity(n=10)Oropharynx(n=17)Hypopharynx(n=36)Tongue(n=17)Gender Male9(90.0%)16(94.1%)35(97.2%)16(94.1%) Female1(10.0%)1(5.9%)1(2.8%)1(5.9%)Age(year) ≥58.54(40.0%)7(41.2%)19(52.8%)11(64.7%) <58.56(60.0%)10(58.8%)17(47.2%)6(35.3%)PD-L1 expression High5(50.0%)10(58.8%)15(41.7%)10(58.8%) Low5(50.0%)7(41.2%)21(58.3%)7(41.2%)Median OS (M)90.077.034.563.0

OS: Overall survival; M: month.

图5 PD-L1高表达和低表达的头颈部癌患者生存差异

Figure 5. Survival Analysis of Patients with High and Low PD-L1 Expression of Head and Neck Cancer

A.No significant difference in survival between high and low PD-L1 expression with Oncomine database; B. No significant difference in survival between high and low PD-L1 expression with GEPIA database.

3 讨 论

据统计，美国2018年新发恶性肿瘤中，口腔及咽喉部癌约占3.7%，其中鳞状细胞癌占90%以上，吸烟是致癌的第一诱因，HPV感染则是口咽部鳞癌的另一大诱因[8-9]。研究显示，HPV感染能促进鳞癌的发生，HNSCC患者中HPV的感染率约57%～72%[10]。近年来，吸烟相关的头颈部肿瘤呈下降趋势，而HPV相关的头颈部癌较前明显增加，发病年龄提前[11-13]。

尽管采用放化疗及靶向治疗，2017年以前，对于复发转移性的HNSCC，铂类药物进展后的治疗方法仅限于单药化疗或化疗联合西妥昔单抗治疗，患者中位生存时间不超过7个月[14-15]。多项研究发现HNSCC细胞表面存在PD-L1过表达，因此免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1单克隆抗体在治疗头颈部癌中也成为了关键调节点。Ⅲ期多中心临床研究CheckMate-141和KEYNOTE-040的研究结果显示，免疫治疗能够改善一线治疗后复发转移的头颈部癌的预后[6-7];KEYNOTE-040研究中，铂类等化疗进展后的HNSCC患者接受每3周200 mg剂量的Pembrolizumab治疗，平均生存期可达到8.4个月，PD-L1高表达的患者甚至达到11.6个月的总生存期。同样在CheckMate-141中，Nivolumab组较化疗组表现出近3倍的生存优势。因此，美国FDA在2016年已经批准最早的两个PD-1单克隆抗体用于复发转移性的HNSCC的二线及后续治疗。目前国内免疫治疗在多种肿瘤中相继开展，但价格昂贵，因此免疫治疗前预测其治疗效果具有一定必要性。

如何挑选免疫治疗潜在有效的患者仍是临床关注的重点问题。在Ib期临床研究KEYNOTE-012中，对于复发转移的HNSCC，HPV(+)患者的客观缓解率为HPV(-)患者的近2倍(25%vs14%)[16]，并且在多项研究中均显示一致结果[17-18]。既往研究也发现，HPV相关的HNSCC可能存在较为独立的异常免疫过程，导致对于HPV感染的长期适应和宿主耐受[19-20]。本文分析显示，HPV(+)患者肿瘤的PD-L1表达量较HPV阴性明显增高，并具有显著差异，这预示在PD-L1状态不明的情况下，HPV状态或可用来预测抗PD-1单克隆抗体的治疗效果。分析还显示PD-L1表达在远处转移的标本中较无远处转移者增高，具有显著差异，提示PD-L1表达可能与肿瘤分期具有相关性，但这个结论仍需要通过全面的临床分期及大样本数据证实。

本文通过oncomine数据库分析显示，头颈部恶性肿瘤的PD-L1表达较正常组织显著增高，与既往研究报道相一致。生存分析显示PD-L1表达量与预后不相关，并且该结果在GEPIA数据库中得到验证。既往有研究显示，实体瘤中PD-L1表达与预后呈负相关，如食管癌、胃癌、泌尿系统恶性肿瘤等[21]，同样该结论在头颈部肿瘤中也得到过验证[22]。然而值得注意的是，作为PD-L1高表达或低表达的界定，至今无统一标准，绝大多数文献中采用免疫组化法，使用肿瘤细胞阳性比例分数作为比较及界定标准。但由于免疫系统同样表达PD-L1，联合阳性分数有时也被作为参考标准。对于PD-L1 mRNA的检测，有采用原位杂交技术，也有本文中数据库采用的转录组测序技术[23]。本文中的分析采用表达量的中位值作为界值，比较高表达与低表达各40例标本的PD-L1表达及总生存期无显著差异，该结果也在GEPIA数据库中得到验证。

作为PD-L1受体的程序性死亡因子受体1基因通常在活化的B细胞、CD4+和CD8+T细胞，树突状细胞、自然杀伤细胞、抗原递呈细胞及单核细胞中表达，既往研究显示在HPV(+)的HNSCC中，PD-L1(+)的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)显著增加[22-24]，该类人群对于抗PD-1免疫治疗的反应率更高[25]。由于HPV感染的HNSCC患者持续表达E6、E7肿瘤蛋白，其可作为免疫治疗的另一靶点，目前已有相关研究正在开展[26]，探讨蛋白靶点与现有的免疫检查抑制剂联合是否能产生协同的效果值得探索。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)在调节性T细胞(Treg)中表达，是调节Treg细胞功能及抗肿瘤免疫活性的关键分子。研究显示，CTLA-4(+)的Treg细胞在头颈部癌中增多[27-28]，特别是在PD-1(+)及CTLA-4(+)的Treg细胞中。在HNC中，不同免疫微环境下CTLA-4的具体意义尚存在争议。在Oncomine数据库中，有一项CTLA-4在HNC中呈现高表达的研究，但因缺乏与其相关的CD80、CD86、PD-1等分子分型数据，未具体分析其表达特点。本文利用Oncomine数据库进行数据分析时，仍存在一些缺陷，因缺乏如多种实验方法确定PD-L1表达，关于PD-1、CTLA4相关表达数据，及临床数据如烟草接触等重要临床数据，无法对肿瘤相关基因、肿瘤分子分型及临床病理特征做进一步深入分析。

共表达分析中显示与PD-L1共表达的基因包括RAC2、EPHB2、FLNA等，目前尚未有关于这些基因的内在联系机制的研究，我们亟待进一步的研究探索。目前Oncomine数据库关于PD-L1、PD-1、CTLA-4相关的数据仍较为有限，希望随着免疫治疗的普及和推广，具有更全面和细化的数据及分类。

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