橡皮生肌膏对大鼠肛瘘术后创面愈合的影响及机制研究

凌水莲 张昊悦 王业皇

摘要 目的：探讨橡皮生肌膏对大鼠肛瘘术后创面愈合的影响及可能的机制。方法：采用综合法构建肛瘘术后创面大鼠模型，将30只模型大鼠随机分为模型组（n=15）与实验组（n=15）;另选15只仅造成创口，不敷粪液作为对照组。实验组予橡皮生肌膏外敷;对照组与模型组予无菌生理盐水纱布外敷，均2次/d，连续干预14 d。采用激光多普勒血流仪测定创面动态血流值;采用HE染色与Wb法检测创面组织病理学特点与VEGF、TNF-α、IL-6蛋白表达。结果：与模型组比较，实验组大鼠创面愈合率显著升高（P<0.05）;在干预第3、7、14天，模型组与实验组大鼠创面动态血流值逐渐升高，但模型组低于对照组，实验组高于模型组（P<0.05）;与对照组比较，模型组大鼠创面组织VEGF蛋白相对表达量显著降低，实验组高于模型组;TNF-α、IL-6蛋白相对表达量升高，实验组低于模型组（P<0.05）。结论：橡皮生肌膏可促进大鼠肛瘘术后创面愈合，改善创面局部血运，其作用机制可能与抑制创面组织TNF-α、IL-6表达，促进VEGF表达相关。

关键词 肛瘘;橡皮生肌膏;愈合率;VEGF;TNF-α;IL-6

Abstract Objective：To explore the effects of Xiangpi ShengJi Ointment on wound healing after anal fistula operation in rats and its possible mechanisms.Methods：The rat models of anal fistula wounds after operation were established by a comprehensive method，and 30 rats models were randomly divided into a model group（n=15）and a test group（n=15）; Another 15 were selected to cause wounds only，and no fecal fluid was used as a control group.The test group were treated with Xiangpi ShengJi Ointment externally; the control group and model group were treated with sterile saline gauze，all 2 times/d，and were intervened continuously for 14 d.Laser doppler flowmeter was used to measure the dynamic blood flow value of the wound; HE staining and Wb method were used to detect the histopathological characteristics and VEGF，TNF-α，IL-6 protein expression.Results：Compared with the model group，the wound healing rate in the test group significantly increased（P<0.05）; on the 3rd，7th and 14th day of intervention，the dynamic blood flow value of the wounds gradually increased in rats in the model group and the test group，but the model group was lower than the control group，and the test group was higher than the model group（P<0.05）; compared with the control group，the relative expression of VEGF protein in the wound tissues significantly reduced in the model group，and that in the test group was higher than that in the model group; the relative expression levels of TNF-α and IL-6 proteins increased.Those in the test group were lower than those of the model group（P<0.05）.Conclusion：Xiangpi ShengJi Ointment can promote wound healing in rats with anal fistula after operation and improve local blood flow，and its mechanisms may be related to inhibiting the expression of TNF-α and IL-6 and promoting the expression of VEGF in the wound tissues.

Keywords Anal fistula; Xiangpi ShengJi Ointment; Healing rate; VEGF; TNF-α; IL-6

肛瘺是肛肠科临床常见疾病，是由原发性内口、瘘管和继发性外口3部分组成，其发病率较高且不能自愈，必须采取手术治疗，但由于手术部位的特殊性，术后流脓、水肿、瘙痒、出血、疼痛等是其常见并发症，严重时还可出现消瘦、发热等症状[1-2]。中医学认为肛瘘的发病以感受风湿燥热之邪或肛痈溃后余毒未清，不能托毒外出，久不收口所致，而肛瘘术后愈合缓慢的创面，属于中医溃疡的范畴，其主要病因为经络受邪，入脏腑，为内所因也;四肢九窍，血脉相传，壅塞不通，为外皮肤所中也;房事、金刃、虫兽所伤，究其病因，肛瘘术后的创面属金刃所伤，临床上以清热解毒、消肿止痛、敛疮生肌为治疗大法[3]。橡皮生肌膏是中医外科具有生肌长皮作用的常用药物，具有防腐收敛、驱痹填髓长肉、生肌敛疮、活血止痛、清热泻火解毒、抗炎、抗感染之功效[4]。为进一步研究橡皮生肌膏对肛瘘术后创面愈合的作用及可能的作用机制，因此本研究构建肛瘘术后创面大鼠模型，旨在为改善肛瘘术后创面愈合提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级、雄性SD大鼠，6周龄，体质量200～220 g，购于扬州大学实验动物中心，动物生产合格证号为SCXK（苏）2017-0007。饲养条件、环境：饲养于扬州大学实验动物中心屏障环境动物实验室，每笼5只，温度（25±2）℃，湿度（55±2）%，光照明暗时间比为12 h/12 h，自由获取食物和水。

1.1.2 药物 橡皮生肌膏（天津达仁堂京万红药业有限公司，生产批号：0923）。

1.1.3 试剂与仪器 苏木精-伊红（HE）染色液（北京维德维康生物技术有限公司，生产批号：180823）;兔抗鼠血管内皮生长因子（VEGF）抗体（英国Abcam公司，生产批号：H181120）;兔抗鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）抗体（美国Santa Cruz公司，生产批号分别为：M181122、M181011）等。

PeriFlux 5000型激光多普勒血流仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号：SKK-1100）;PowerLab Chart5 v5.2.2图像分析软件（美国ADInstruments公司，型号：ADKS-3100）;KD-202型石蜡切片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号：KDS-1711）;5810R型高速低温离心机（德国Eppenndorf Centrifuge公司，型号：ESD-1733）;DM LB2型光学显微镜（德国Leica公司，型号：LKS-1610）;M200 PRO型多功能酶标仪（瑞士TECAN公司，型号：TEF-1510）;QuantityOne 1-D分析软件（美国Bio-Rad公司，型号：BID-1611）等。

1.2 方法

1.2.1 实验动物模型建立[5]、分组 采用综合法构建肛瘘术后创面大鼠模型，术前备皮，氯胺酮（100 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，采用创伤制作器在脊柱旁侧0.5 cm处切割直径约为1.8 cm的圆形创口，且肌层伤口厚度约为0.3 cm，止血后在创面上加粪液1 mL，固定（油纱、敷料、胶带），48 h后去除覆盖物，若见伤口有脓性分泌物与粪臭味出现，表示造模成功。将成功建立的30只肛瘘术后创面大鼠随机分为模型组（n=15）及实验组（n=15）;另选择15只仅造成创口后不敷以粪液作为对照组。

1.2.2 干预方法 实验组大鼠伤口给予等面积的橡皮生肌膏完全覆盖创面，其上再盖无菌纱布并固定;对照组与模型组给予无菌生理盐水纱布外敷并固定;3组均每天换药2次，连续干预14 d。

1.2.3 创面愈合率测定 末次干预结束后，观察、测定各组大鼠的创面愈合情况[6]。创面愈合率=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积×100%。

1.2.4 激光多普勒血流仪测定创面动态血流值 于干预第3、7、14天，采用激光多普勒血流仪测定创面动态血流值，将MSP2OOXP表面探头放置在肛瘘内口创面上，每个创面选3个点（以肛瘘内口的顶端为第1个点，在瘘道走行方向上取第2和第3个点），每点记录30 s，采用PowerLab Chart5 v5.2.2图像分析软件进行分析，取其3点测量值的平均值作为该内口创面的血流值[7]。

1.2.5 苏木精-伊红（HE）染色[8]观察创面组织病理学特点 干预第14天的创面动态血流值测定后，颈椎脱臼法处死大鼠，采集创面组织，10%甲醛固定液固定45 min后，经脱水、包埋、切片等制作石蜡切片，进行常规HE染色，于光学显微镜下观察创面组织病理学特点。

1.2.6 蛋白免疫印迹（Wb）法[9]检测创面组织VEGF、TNF-α、IL-6蛋白的表达水平 取液氮中保存的创面组织，冷研磨后加入细胞裂解液，12 000 r/min离心10 min，测定蛋白量。取待测样品（20 μg）进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜后封闭2 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜，加入二抗，常温下孵育2 h。采用QuantityOne 1-D分析软件分析各条带的灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参β-actin灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，符合正态分布时，2组之间比较采用Dunnett′s t检验;不符合正态分布时，采用秩和检验分析。

2 结果

2.1 各组大鼠的创面愈合率比较 模型组与实验组大鼠创面愈合率分别为（12.37±2.64）%、（78.64±5.12）%;与模型组比较，实验组大鼠创面愈合率显著升高（P<0.05）。

2.2 各组大鼠创面动态血流值比较 在干预第3、7、14天，模型组与实验组大鼠创面动态血流值逐渐升高，但与对照组比较，模型组大鼠创面动态血流值降低，且实验组高于模型组（P<0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠创面组织病理学特点 模型组大鼠可见创面以瘢痕修复为主，有少量肉芽組织形成，且伴有大量炎性细胞浸润;实验组大鼠可见创面有较多肉芽组织增生、成熟，同时可见血管增生，表皮增生角化，且炎性细胞浸润明显减少，修复良好;而对照组大鼠相应位置的组织结构完整，无异常变化。见图1。

2.4 各组大鼠创面组织VEGF、TNF-α、IL-6蛋白的表达水平 与对照组比较，模型组大鼠创面组织VEGF蛋白相对表达量显著降低，且实验组高于模型组;模型组大鼠创面组织TNF-α、IL-6蛋白相对表达量升高，且实验组低于模型组（P<0.05）。见表2，图2。

3 讨论

肛瘘是一种反复发作的肛肠疾病，由于其发病部位的特殊性，术后创面不易保持清洁、干燥，所以切口一般不予缝合，故术后创面愈合缓慢、伤口疼痛，病程长;术后创面愈合情况是手术成败的主要决定因素，同时炎性反应与创口血运是影响创面愈合的重要原因[10]。在传统中医学中，肛瘘称为“肛漏”，病机多为肛痈溃后余毒未尽，结滞不散;或脏腑素虚，复感邪毒，气血壅结，肉腐成脓，因此，当以清热燥湿、补气化瘀为治疗原则;对创面进行局部的换药目的旨在祛腐生肌、拔脓消肿，运用中药方消除肛瘘术后及溃疡创面水肿、渗液，改善创面局部血运，促进创面新组织增生，使新生的肉芽组织逐渐填充创腔，以达到促进创面愈合的目的[11]。橡皮生肌膏组方出自于张山雷《疡科纲要》，药物组成主要包括橡皮、当归、地黄、血余炭、炉甘石、石膏等，其中橡皮具有止血、敛疮的功效;当归补血活血、消肿止痛、排脓生肌;地黄具有清热、生津滋阴、凉血之功效;血余炭有消瘀、止血之功;炉甘石有解毒、收湿止痒敛疮之功;石膏清热解毒、泻火，诸药合用具有防腐收敛、生肌敛疮、清热解毒、活血止痛之功效[12]。研究[13]发现，象皮生肌膏可提高压疮缺血再灌注损伤大鼠新生肉芽组织中纤维结合蛋白含量，促进压疮伤口愈合。本研究结果显示，实验组大鼠创面愈合率与创面动态血流值均显著高于模型组，且创面肉芽组织形成情况优于模型组，提示橡皮生肌膏可促进大鼠肛瘘术后创面愈合，改善创面局部血运，从而缓解病情。

创面修复是多因子参与的复杂调控过程，而炎性反应与创口局部血供情况是影响肛瘘创面愈合、修复的重要因素[14]。炎性反应是机体创伤后的基本防御性反应，TNF-α、IL-6是常见炎性因子，可促进机体炎性反应，参与肛瘘术后多种并发症的发生与进展[15]。研究显示，参黄洗液熏洗可促进痔术后创面愈合，其机制可能与下调大鼠血清中IL-8及TNF-α水平有关[16]。现代药理学研究表明，橡皮生肌膏中的地黄与炉甘石可抗炎、止痒;血余炭抗炎、抑菌、镇痛;石膏也具有抗炎、镇痛作用[17]。曹晖等[18]研究发现，象皮生肌膏可明显提高大鼠肛瘘术后创面愈合率，缩短创面愈合时间，其作用机制可能与降低创面组织中炎性反应因子表达有关。本研究结果显示，实验组大鼠创面组织TNF-α、IL-6蛋白相对表达量均低于模型组，提示橡皮生肌膏可抑制大鼠肛瘘术后创面组织中炎性因子表达，缓解炎性症状。血管生成对创面组织愈合至关重要，VEGF是重要的血管生长因子，可促进内皮细胞增殖，有利于毛细血管形成，改善创面微循环，从而促进创面愈合[19]。现代药理学研究表明，橡皮生肌膏组方中的当归具有促进血管内皮细胞增殖进而促进血管再生的作用[20]，但目前尚无关于橡皮生肌膏对VEGF作用的相关报道，本研究结果显示，实验组大鼠创面组织VEGF蛋白相对表达量显著高于模型组，提示橡皮生肌膏可促进大鼠肛瘘术后创面组织中VEGF蛋白表达，促进血管生成，改善创面微循环，最终促进创面愈合。

综上所述，橡皮生肌膏可促进大鼠肛瘘术后创面愈合，改善创面局部血运，同时抑制大鼠肛瘘术后创面组织中炎性因子表达，促进VEGF蛋白表达，最终促进创面愈合，这为临床肛瘘术后创面愈合的治疗提供了新思路，也为橡皮生肌膏的推广使用提供了理论依据。

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